Efectos vasculares y pulmonares del ibuprofeno en el desarrollo pulmonar neonatal

Abstracto

Fondo

El ibuprofeno es un fármaco antiinflamatorio no esteroideo que se usa comúnmente para estimular el cierre de un conducto arterioso permeable (PDA) en bebés muy prematuros y puede provocar un desarrollo pulmonar neonatal aberrante y displasia broncopulmonar (DBP).

Métodos

Investigamos el efecto del ibuprofeno sobre la angiogénesis en células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano (HUVEC) y el potencial terapéutico del tratamiento diario con 50 mg/kg de ibuprofeno inyectado por vía subcutánea en crías de ratas Wistar recién nacidas con DBP experimental inducida por hiperoxia grave. Los parámetros investigados incluyeron crecimiento, supervivencia, histopatología pulmonar y expresión de ARNm.

Resultados

El ibuprofeno inhibió la angiogénesis en las HUVEC, como lo demuestra la reducción de la formación de tubos, la migración y la proliferación celular a través de la inhibición de la fase S del ciclo celular y la promoción de la apoptosis. El tratamiento de crías de rata recién nacidas con ibuprofeno redujo la densidad de los vasos pulmonares en el pulmón en desarrollo, pero también atenuó la DBP experimental al reducir la inflamación pulmonar, el agrandamiento alveolar, el grosor del tabique alveolar y el engrosamiento de la pared arteriolar pequeña.

Conclusiones

En conclusión, el ibuprofeno tiene efectos duales sobre el desarrollo pulmonar: efectos adversos sobre la angiogénesis y efectos beneficiosos sobre la alveolarización y la inflamación. Por lo tanto, la extrapolación de los efectos beneficiosos del ibuprofeno a los bebés prematuros con displasia broncopulmonar debe realizarse con extrema precaución.

Fondo

Los grandes avances en cuidados intensivos neonatales no han reducido la incidencia de displasia broncopulmonar (DBP) o enfermedad pulmonar crónica neonatal (EPC) en bebés prematuros, porque el aumento de la supervivencia neonatal ha desplazado a la población afectada a bebés prematuros nacidos con menos de 28 semanas de gestación [1, 2]. La incidencia de BPD es estable en 35 a 40% de los bebés extremadamente prematuros. [2, 3]. El tratamiento de la insuficiencia respiratoria debido a la inmadurez pulmonar y la deficiencia de surfactante en estos bebés extremadamente prematuros con asistencia respiratoria invasiva y oxígeno suplementario puede dañar el pulmón en desarrollo de forma permanente. [4]. La DBP se caracteriza por una superficie alveolar reducida y una función pulmonar alterada debido al agrandamiento de los alvéolos causado por el daño pulmonar inducido por el estrés oxidativo y la detención del desarrollo alveolar. [1]. Las agresiones prenatales, la inflamación perinatal, el estrés oxidativo y la hipertensión arterial pulmonar (HAP) complican la patogenia de la DBP y contribuyen a la enfermedad pulmonar del adulto, como la EPOC, a edades relativamente jóvenes [2, 3, 5, 6]. Falta un tratamiento farmacológico eficaz para el TLP y es muy necesario.

La rata neonatal es un modelo animal adecuado para estudiar la patogénesis de la DBP y nuevas opciones de tratamiento [7,8,9,10]. Estos roedores nacen durante la etapa sacular del desarrollo pulmonar, imitando la etapa de desarrollo pulmonar de los bebés con alto riesgo de BPD, y desarrollan inflamación pulmonar crónica, seguida de simplificación alveolar persistente, fibrosis pulmonar, PAH e hipertrofia ventricular derecha (HVD) después de la exposición a la hiperoxia [1, 11].

El ibuprofeno es un potente fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) que se usa ampliamente para el tratamiento del cáncer colorrectal, la inflamación pulmonar en la fibrosis quística y el cierre de un conducto arterioso permeable (PDA) en recién nacidos prematuros. [12,13,14,15]. Sin embargo, la información sobre su efecto sobre el desarrollo pulmonar aberrante después del nacimiento prematuro y la patogenia de la displasia broncopulmonar es incompleta y controvertida, y va desde preocupaciones sobre efectos adversos, sin impacto, hasta efectos beneficiosos sobre la displasia broncopulmonar en bebés prematuros. [15,16,17,18,19,20]. Nuestro estudio clínico anterior y un metanálisis han indicado un mayor riesgo de DBP en los lactantes tratados con ibuprofeno [16, 20]. Otros estudios experimentales sugirieron un efecto antiangiogénico del ibuprofeno en la angiogénesis ocular en ratas recién nacidas [21] y desarrollo embrionario en pez cebra [22]. Teniendo en cuenta el papel esencial de la angiogénesis en la patogénesis de la DBP [2] y el hecho de que cada año millones de bebés prematuros reciben ibuprofeno para el cierre del CAP [17]de los cuales algunos están expuestos a cursos repetidos o prolongados de tratamiento con ibuprofeno [23]existe una necesidad urgente de desentrañar el papel potencial del ibuprofeno en el desarrollo pulmonar normal y la patogénesis de la DBP después del nacimiento prematuro.

Para avanzar en nuestro conocimiento sobre el efecto del tratamiento con ibuprofeno en el desarrollo pulmonar perinatal y la DBP, estudiamos el efecto del ibuprofeno en la función de las células endoteliales en células endoteliales de vena umbilical humana cultivadas (HUVEC), y el efecto en el desarrollo alveolar y vascular y la inflamación pulmonar en ratas neonatales mantenidas en condiciones de normoxia o hiperoxia para inducir BPD experimental [24].

Materiales y métodos

Estudios in vitro

Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)

Las HUVEC se aislaron del cordón umbilical, como se informó anteriormente [25]. Brevemente, se recogió un cordón umbilical de 10 a 20 cm de longitud después de obtener el consentimiento de los padres y se procesó en una cabina de riesgo biológico. Se canuló la vena umbilical y se enjuagó con solución salina estéril al 0,09% para eliminar la sangre. Se inyectó un mililitro de colagenasa al 0,2 % (C0103, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en la vena umbilical y se incubó durante 10 min a 37 °C. Se apretó suavemente el cordón umbilical para facilitar el desprendimiento de las células endoteliales. Posteriormente, la vena umbilical se enjuagó con medio de células endoteliales (ECM, 1001, ScienCell, Carlsbad, CA, EE. UU.), que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS, SV30208, HyClone, Marlborough, MA, EE. UU.) y Pen/Strep (# 15140-122, Gibco, Fremont, CA, EE. UU.) para recolectar las células. Las HUVEC se recolectaron por centrifugación a 750 ×gramo durante 10 min, resuspendido en medio y cultivado a 37 °C en 95 % aire/5 % CO2 humedecido con agua. Las células dentro del pasaje 3–7 se usaron para los experimentos.

Ensayo de formación de tubos

Las placas de 96 pocillos se enfriaron previamente y se recubrieron con 50 µl de matriz de membrana basal Matrigel (# 354234, Corning, NY, EE. UU.) por pocillo. Las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h para permitir que el sótano polimerizara. Después de que el gel se solidificó, 1 × 104 Las HUVEC se sembraron con 100 μl de ECM completa que contenía DMSO (0,1 %, v/v) o 100 μM, 500 μM o 1000 μM de ibuprofeno. Las placas se incubaron a 37 °C en 95 % de aire/5 % de CO2 durante 6 h. La formación de tubos de HUVEC en diferentes condiciones se fotografió con una cámara montada en un microscopio (IX73, Olympus, Tokio, Japón) y se analizó con el software Image J (NIH, EE. UU.). Se realizaron cinco repeticiones técnicas.

Ensayo de cicatrización de heridas

Las HUVEC se sembraron en una placa de 12 pocillos a 2 × 105 células/pocillo en ECM complementado con 10 % de FBS y 1 % de Pen/Strep. Las células alcanzaron una confluencia de 80-90% después de 24 horas de incubación. Luego, se retiró el medio de cultivo, se rascaron las monocapas usando una punta de pipeta de 200 µL para hacer una herida recta. La herida se enjuagó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubó con ECM libre de FBS y se trató con DMSO (0,1%, v/v), 100 µM, 500 µM y 1000 µM de ibuprofeno disuelto en DMSO durante 24 h a 37 °C en 95 % aire/5 % CO2. El proceso de curación fue monitoreado bajo un microscopio. Las heridas se fotografiaron a las 0, 12 y 24 h después del rasguño y se analizaron con el software Image J. Se analizaron al menos 5 imágenes de cada pozo en tres repeticiones técnicas.

inmunofluorescencia

Las HUVEC tratadas con diferentes concentraciones de ibuprofeno se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 %. Luego, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo Ki67 (ab16667, Abcam, Fremont, CA, EE. UU.; diluido 1: 250), marcador de daño en el ADN, 8-hidroxi-2′-desoxiguanosina (8-OHdG, 12501, QED Bioscience, San Diego, CA, EE. UU.; diluido 1:1000), o BSA al 1 % (A1933, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) como control, seguido de incubación con burro conjugado con Alexa Fluor 488/555 anticuerpo anti-conejo/ratón (A-21206 y A21422, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU., diluido en 1:1000) durante 2 h en la oscuridad. Las células se cubrieron con reactivo antifade Prolong Gold con DAPI (8961, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) y…

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