Resumen
Antecedentes
El edema pulmonar de gran altitud (HAPE) plantea un desafío médico significativo para las personas que ascienden rápidamente a altitudes. Los cambios morfológicos celulares inducidos por hipoxia en la barrera alveolar-capilar, como las alteraciones estructurales mitocondriales y la reorganización del citoesqueleto, juegan un papel crucial en la patogénesis de HAPE. Estos cambios morfológicos son críticos para comprender la respuesta celular a la hipoxia y representan objetivos terapéuticos potenciales. Sin embargo, todavía existe una falta de estrategias efectivas y válidas de descubrimiento de fármacos para los tratamientos anti-hape basados en estas características morfológicas celulares. Este estudio tiene como objetivo desarrollar una tubería que se centre en las alteraciones morfológicas en las imágenes de pintura celular para identificar posibles agentes terapéuticos para las intervenciones HAPE.
Métodos
Generamos más de 100,000 imágenes de pintura celular de campo completo de células epiteliales basales de adenocarcinoma alveolar humano (A549S) y células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC) en diferentes condiciones hipóxicas (1% ~ 5% del contenido de oxígeno). Estas imágenes se enviaron luego a nuestra red de segmentación recientemente desarrollada (SGNET), que exhibió un rendimiento superior que los métodos tradicionales, para proceder a la detección y segmentación de la estructura subcelular. Posteriormente, creamos una red de puntuación de hipoxia (Hyponet) utilizando más de 200,000 imágenes de estructuras subcelulares de A549 y HPMEC, lo que demuestra una capacidad sobresaliente en la identificación del estado de hipoxia celular.
Resultados
Propusimos una tubería de detección de fármacos (CPHNET) basada en redes neuronales profundas, que facilitó la identificación de dos productos naturales prometedores, ácido ferúlico (FA) y resveratrol (RES). Ambos compuestos demostraron efectos satisfactorios anti-HAPE en un modelo de chip 3D-álvéolo (ex vivo) y un modelo de ratón (in vivo).
Conclusión
Este trabajo proporciona una tubería nueva y efectiva para evaluar a los agentes anti-HAPE integrando herramientas de inteligencia artificial (IA) y pintura celular, ofreciendo una perspectiva novedosa para el descubrimiento de fármacos fenotípicos impulsados por la IA.
Fondo
El edema pulmonar a gran altitud (HAPE) presenta un desafío médico significativo, particularmente a las personas que ascenden rápidamente a altas altitudes sin una aclimatación adecuada (1, 2). Esta condición, caracterizada por la acumulación de fluidos en el pulmón, puede progresar rápidamente a un estado potencialmente mortal si no se aborda (3). El inicio de HAPE implica factores complejos, que incluyen hipertensión pulmonar, inflamación y cambios en la barrera alveolar-capilar. Sin embargo, los mecanismos específicos siguen sin estar claros (4, 5). Estudios recientes indican que la hipoxia y la hipertensión pulmonar pueden conducir a la activación de la señalización de VEGF, lo que resulta en una mayor permeabilidad de la barrera alveolar-capilar (6, 7). Es probable que este cambio sea un factor clave en la patogénesis de HAPE, ya que permite que el fluido se filtre en los espacios alveolares, lo que lleva al edema pulmonar (1). Además, las alteraciones morfológicas y funcionales inducidas por hipoxia en las células endoteliales vasculares y las células epiteliales alveolares se consideran determinantes críticos en la patogénesis de la hipertensión pulmonar (8, 9). Por lo tanto, vale la pena desarrollar modelos para investigar los efectos de intervención de los agentes en los cambios celulares inducidos por hipoxia para facilitar la detección eficiente de los posibles agentes anti-HAPE.
La pintura celular, una evolución de la detección de alto contenido (HCS), emplea seis tintes diferentes para manchar varias estructuras subcelulares e imágenes en múltiples canales (10). Esta tecnología puede identificar el mecanismo de acción (MOA) de los agentes temprano en el desarrollo de fármacos, guiando la expansión de HIT basada en las relaciones de estructura-fenotipo y evitando la mala interpretación asociada con objetivos nominales (11, 12). La pintura celular puede proporcionar datos morfológicos exhaustivos, mejorar la confiabilidad de los análisis fenotípicos y facilitar la rápida identificación de agentes que mejoran efectivamente los fenotipos celulares relacionados con HAPE, lo que aumenta las tasas de éxito de la detección y el desarrollo de fármacos (acelerando el desarrollo de fármacos ((13). A pesar de esto, la evaluación cuantitativa imparcial de los cambios morfológicos en una gran cantidad de imágenes de pintura celular es un desafío utilizando métodos convencionales. Un sistema de puntuación que puede evaluar cuantitativamente los estados celulares podría ser una herramienta crucial para la detección de medicamentos, lo que permite una identificación más precisa y eficiente de agentes terapéuticos prometedores (14, 15). Los avances recientes en el aprendizaje profundo han mejorado significativamente el análisis de imágenes celulares, ofreciendo herramientas eficientes para interpretar cambios morfológicos complejos (16, 17). Estos métodos de IA, como la familia Yolo (18), podría extraer efectivamente células individuales e identificar características morfológicas intrincadas a partir de imágenes de alto contenido, facilitando la clasificación rápida y automatizada de los fenotipos celulares, así como la evaluación precisa de los efectos del fármaco (19,20,21).
El entorno fisiológico real implica interacciones intrincadas entre múltiples tipos de células dentro de estructuras tridimensionales complejas, que los cultivos de células bidimensionales convencionales no pueden replicarse adecuadamente. La tecnología de órgano en chip (OOC) une efectivamente esta brecha al simular condiciones fisiológicas clave, como las interacciones de células a células y las fuerzas mecánicas, que ofrece un modelo que se parece más al entorno humano in vivo (22). En comparación con los métodos tradicionales de cultivo celular, la tecnología OOC proporciona una evaluación más precisa de la eficacia del fármaco, al tiempo que reduce significativamente la dependencia de las pruebas en animales (23). Sin embargo, los modelos in vivo siguen siendo indispensables para validar la precisión y la relevancia traslacional de los hallazgos in vitro. Los ratones C57BL/6, por ejemplo, exhiben respuestas inflamatorias inducidas por hipoxia en los tejidos pulmonares que reflejan de cerca los mecanismos observados en HAPE humano, lo que las hace particularmente adecuadas para confirmar la confiabilidad de los datos OOC y garantizar que estos sistemas microfisiológicos puedan transferir efectivamente a aplicaciones clínicas (24,25,26).
En este estudio, planteamos la hipótesis de que el aprendizaje profundo podría identificar con precisión las alteraciones morfológicas de las células hipóxicas de las imágenes de pintura celular y proponer una tubería nueva, CPHNET, para la identificación de posibles terapéuticas para HAPE (Fig. S1). Esta tubería pasa el proceso de detección de un procedimiento manual o semiautomado a uno totalmente automatizado al emplear dos modelos de aprendizaje profundo: una red de segmentación (SGNET) y una red de puntuación de hipoxia (Hyponet). Segnet detecta y segmentos de manera efectiva estructuras subcelulares en imágenes de campo completo de A549 y HPMEC. Hyponet sobresale para evaluar el alcance de la hipoxia en estas células. Finalmente, aplicamos CPHNET en los agentes anti-HAPE potenciales de detección y validamos los resultados utilizando tecnología OOC y modelos animales.
Métodos
Cultivo celular y tratamiento de hipoxia
Grupo de entrenamiento
De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las líneas celulares A549 y HPMEC (obtenidas del repositorio de células ATCC) se cultivaron en DMEM con la adición de FBS al 10%, L-glutamina (0.292 mg/ml), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). Las células se sembraron a una densidad de 8000 células por pozo en placas negras fenoplatetm-ultra de 96 pocillos (Perkinelmer, 6055302). Se prepararon cuatro placas paralelas para cada línea celular y se incubaron durante la noche en una incubadora de cultivo celular CO2 de 37 ° C, al 5%. Después de la adherencia, tres de las placas para cada línea celular se transfirieron a cámaras de cultivo hipóxico establecidos a niveles de oxígeno de 1%, 3% y 5% respectivamente, con las condiciones mantenidas a 37 ° C y 5% de CO2 durante una duración de 24 h. Mientras tanto, la cuarta placa para cada línea celular se dejó cultivada bajo concentración estándar de oxígeno durante el mismo plazo. Posteriormente, las cuatro placas se sometieron a tinción y imagen celular.
Grupo de detección
A549 y HPMEC se dividieron en un grupo de normoxia (NH), un grupo de hipoxia del 5% (HY) y once grupos de tratamiento de hipoxia, totalizando 13 grupos (n = 6). Cada grupo se sembró con 3000 células por pozo en placas negras. After cell adhesion, the hypoxia treatment groups underwent medium changes, and 0.1 µM tetramethylpyrazine (Macklin, T819555), 0.68 µM tanshinone IIA (MCE, HY-N0135), 0.64 µM salvianolic acid B (MCE, HY-N1362), 0.05 µM salvianolic acid C (MCE, Hy-N0319), 0.05 µm 20 (S) -ginsenoside RH2 (China Pharmacopeye Institute, 111748), 0.05 µM de acetazolamida (Aladdin, A194116), 0.1 µM Catechin (MCE, HY-N0898), 0.1 µM Reseratrol (Charmacopeoe Institute, 111535) 0.025 µM ácido ferúlico (Instituto de Farmacopeo China, 110773), 0.01 µg/ml de píldoras de goteo Danshen (Administración Nacional de Productos Médicos, Z10950111) y 0.005 µg/ml de Capsulas Hongyi (aprobación de medicina militar, Z2019006) en un formato de cambio medio (Fig. S2). El grupo NH y el grupo HY se sometieron a cambios medios regulares. Después de 24 h de incubación, los grupos de tratamiento con el grupo HY y la hipoxia se transfirieron a una cámara de cultivo hipóxico de tres gas durante 24 h adicionales, con el grupo NH cultivado bajo concentración normal de oxígeno durante este período. Después de la eliminación, las células se mancharon y se tomaron imágenes.
Manchas de células
El kit de imágenes de células fenovue contiene seis tintes necesarios para experimentos de imágenes celulares. Estos colorantes correspondieron a varios compartimentos celulares: la tinción nuclear 33,342 ADN marcado; La 488 Concanavalin A marcó el retículo endoplásmico; La tinción de ácido nuclear 512 marcaba nucleolos y ARN citoplasmático; Las 568 faloidina se usaron para etiquetar el citoesqueleto de actina; El 555 WGA marcó la membrana plasmática y el aparato de Golgi; y la mancha mitocondrial 641 marcada mitocondria. Sustituimos Fenovue Fluor 555-WGA con Cellbrite Fix 555 (Biotium, 30088 A). Fenovue Fluor 641 mitocondrial y tinción de ácido-ácido nucleico fenovue 512 se combinaron en una solución de dilución de colorante para preparar la solución de tinción 1, mientras que los colorantes restantes se diluyeron en otra solución para preparar …
(Tagstotranslate) Edema pulmonar de gran altitud (hape)
