Resumen
Antecedentes
La exposición pulmonar a nanotubos de carbono de paredes múltiples (MWCNT) induce respuestas potentes proinflamatorias y profibróticas en modelos de ratones de enfermedad pulmonar alérgica. Recientemente informamos que los MWCNT exacerbaron los componentes de la enfermedad pulmonar alérgica inducida por el polvo de la casa (HDM), incluida la inflamación eosinofílica, la metaplasia de las células mucosas y la fibrosis de las vías respiratorias. El receptor 2 activado por proteasa (PAR2) juega un papel importante en el desarrollo de diversas enfermedades respiratorias, incluida el asma y la fibrosis pulmonar. Sin embargo, los estudios que investigan la función de PAR2 en la enfermedad pulmonar alérgica han producido resultados variables. Para definir aún más el papel de PAR2 en la patología pulmonar, investigamos los efectos de los MWCNT sobre la enfermedad pulmonar alérgica inducida por HDM en ratones con mutantes PAR2.
Métodos
Los ratones mutantes par2 utilizados se generaron previamente reemplazando una región de 1.8 kb de la secuencia de codificación PAR2 con un gen de resistencia a la neomicina, que no eliminó por completo el gen. Los ratones C57BL/6J de tipo salvaje (WT) y ratones machos mutantes PAR2 se expusieron a una solución de vehículo, MWCNT, extracto HDM o ambos a través de aspiración orofaríngea seis veces más de 3 semanas. Se recolectó líquido de lavado broncoalveolar (BALF) para medir los cambios en las células inflamatorias, la proteína total y la lactato deshidrogenasa (LDH). La proteína pulmonar y el ARNm se analizaron para mediadores proinflamatorios y profibróticos, y las secciones pulmonares fijadas por formalina se evaluaron para la histopatología.
Resultados
En ratones con mutantes WT y PAR2, la exposición conjunta a MWCNT y el extracto de HDM aumentó significativamente la inflamación pulmonar eosinofílica, la metaplasia de las células mucosas, el aumento de la celularidad del BALF, la proteína total de la BALF y los niveles de LDH. Estos resultados no fueron significativamente diferentes entre los genotipos. Además, los MWCNT y la coexposición de extractos de HDM aumentaron significativamente la fibrosis de las vías respiratorias en ratones WT y PAR2 mutantes, caracterizados por una mayor deposición de colágeno de las vías respiratorias y la expresión de ARNm de Col1a1. La morfometría cuantitativa reveló una disminución significativa en la fibrosis de las vías respiratorias en ratones mutantes PAR2 en comparación con ratones WT, acompañado de ARNm de Col1A1 reducido según lo detectado por PCR. A pesar de esta reducción, la proteína del mediador profibrótico arginasa 1 (Arg-1) y los niveles de ARNm se regularon significativamente en ratones mutantes PAR2.
Conclusión
Nuestro estudio demuestra que PAR2 media la fibrosis de las vías respiratorias, pero no influye en la inflamación pulmonar eosinofílica o la metaplasia de células mucosas causadas por la coexposición a MWCNT y alergeno HDM.
Introducción
El asma alérgica es una enfermedad respiratoria causada por la predisposición genética y la exposición ambiental a los alérgenos, que afecta a más de 300 millones de personas en todo el mundo. Durante la última década, la prevalencia del asma ha aumentado, aumentando las preocupaciones sobre esta enfermedad crónica (1). La investigación se ha centrado cada vez más en la exacerbación del asma, ya que los factores ambientales pueden amplificar las características patológicas de la enfermedad pulmonar alérgica y empeorar síntomas debilitantes como la broncoconstricción. Por ejemplo, se sabe que las infecciones respiratorias virales y bacterianas agudas exacerban el asma alérgica (2, 3). Además, la inhalación de partículas en el aire, incluida las partículas ultrafinas de fuentes naturales o antropogénicas, puede conducir a una exacerbación prolongada del asma (4, 5). Los estudios que utilizan modelos murinos con extractos de ácaros de polvo doméstico (HDM) de dermatófagoides pteronyssinus han demostrado que las partículas inhaladas empeoran la enfermedad pulmonar alérgica al aumentar la inflamación eosinofílica, la metaplasia de las células mucosas y la fibrosis de las vías aéreas (6). Por lo tanto, las partículas inhaladas son un factor ambiental importante que contribuye a una mayor gravedad y exacerbación de la enfermedad pulmonar alérgica.
Los nanomateriales de ingeniería (ENM) son una preocupación significativa para la salud pulmonar humana debido a su pequeño tamaño (10-100 nm) y la capacidad de infiltrarse en los pulmones cuando se inhalan (7). Los nanotubos de carbono de paredes múltiples (MWCNT), un tipo de ENM, poseen propiedades fisicoquímicas únicas, como la alta resistencia a la tracción y la funcionalización de la superficie, lo que los convierte en un material atractivo para aplicaciones diversas, incluidos recubrimientos industriales, compuestos de peso ligero y electrónica (electrónica (8). La toxicidad de los MWCNT se debe en parte a su estructura similar a la fibra que promueve una penetración profunda de los tejidos pulmonares y subpleurales después de la inhalación con la posterior activación de células inmunes innatas como los macrófagos, lo que conduce a una lesión pulmonar (9, 10). Además, la inhalación de MWCNT solo induce la inmunosupresión sistémica y causa fibrosis intersticial en los pulmones de ratones, potencialmente mediado por la regulación positiva de la producción de TGF-β1 (11). Estudios recientes que examinan modelos animales experimentales de asma alérgica han revelado que la exposición pulmonar a los MWCNT, en combinación con alérgenos HDM, amplifica la inflamación de las vías respiratorias, la fibrosis y la producción de citocinas proinflamatorias, exacerbando la enfermedad pulmonar alérgica ((6, 12,13,14). Mientras que la inhalación de MWCNT altera y exacerba la respuesta inmune alérgica a los alérgenos, los mecanismos por los cuales estas partículas mejoran la enfermedad pulmonar inducida por alérgenos no se entienden bien.
El receptor 2 activado por proteasa (PAR2) es un receptor acoplado a proteína G de la superficie celular (GPCR) expresado por varios tipos de células pulmonares, incluidas las células epiteliales bronquiales y alveolares, los macrófagos alveolares residentes y los fibroblastos. PAR2 juega un papel crucial en la detección del entorno proteolítico extracelular (15, 16). Serina y cisteína proteasas endógenas como triptasa, tripsina, factor VIIA, factor Xa y elastasa, liberada o generada durante la lesión pulmonar, escindida PAR2, lo que lleva a la activación del receptor y la señalización posterior (17, 18). Además, PAR2 puede activarse proteolíticamente por las proteasas que se encuentran en HDM, como Der P1, Der P3 y Der P9 (19, 20). Estas proteasas escinden el receptor dentro del extremo N-extremo extracelular, exponiendo un dominio de ligando atado al péptido que se une a las regiones conservadas en PAR2, activando el receptor (21, 22). Esta interacción desencadena cambios conformacionales y altera la afinidad del receptor por las proteínas G intracelulares, mediando la señalización del receptor aguas abajo. Es importante destacar que PAR2 contiene múltiples sitios de escisión N-terminal con unión preferencial de proteasa, lo que lleva a respuestas celulares específicas de la proteasa a través del mismo receptor (22). La prevalencia y el papel multifacético de PAR2 en el microambiente pulmonar lo implican en la patogénesis de varias enfermedades respiratorias, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar y el asma (asma (23). La naturaleza compleja de PAR2 ha hecho difícil aclarar su papel preciso en la patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias e inmunes.
Los estudios sobre PAR2 en ratones han producido resultados variables con respecto a su papel en la patogénesis de las enfermedades pulmonares alérgicas. Nuestro grupo examinó previamente el papel de PAR2 en la exacerbación de la enfermedad pulmonar alérgica inducida por HDM por MWCNT utilizando ratones PAR2 Knockout (KO), una deleción génica completa del receptor (6). Encontramos que la exposición co-exposión a MWCNT y el extracto HDM aumentó sinérgicamente los números de eosinófilos en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) sin diferencias significativas entre los ratones de tipo salvaje (WT) y PAR2 KO. Curiosamente, los ratones expuestos a MWCNT o extracto HDM solo no mostraron diferencias discernibles en la deposición de colágeno. Sin embargo, la morfometría cuantitativa de las secciones de pulmón histopatológicas positivas para tricoma reveló que la exposición conjunta a MWCNT y el extracto de HDM aumentó significativamente la deposición de colágeno alrededor de las vías respiratorias y los vasos sanguíneos pulmonares, con ratones WT desarrollando significativamente más fibrosis de vías aéreas que los ratones PAR2 KO ((6). Estos datos sugieren que la activación de PAR2 contribuye al desarrollo de la fibrosis pulmonar, pero no media la exacerbación de la inflamación pulmonar eosinofílica inducida por HDM por MWCNT. En contraste, investigaciones anteriores han indicado que PAR2 puede regular la motilidad celular y la inflamación de las vías respiratorias. Por ejemplo, se ha informado que la administración de péptidos agonistas PAR2 reduce la neutrofilia estimulada por lipopolisacárido (LPS) en las vías respiratorias murinas, lo que sugiere un mecanismo antiinflamatorio para PAR2 (16). Sin embargo, también se ha informado que administrar un péptido de bloqueo de PAR2 antes de que la exposición al alérgeno inhiba la hiper-respuesta e inflamación de las vías respiratorias, lo que sugiere que la señalización de PAR2 media la respuesta inmune en el asma alérgico (24). Además, se ha debatido el papel de PAR2 en la fibrosis de las vías respiratorias. Por ejemplo, la deficiencia de PAR2 lograda por una mutación nula homocigota en el gen PAR2, que reduce el gen de 8 kb a un gen de 5 kb, no afectó la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (25, 26). En contraste, los ratones con deleción génica completa de PAR2 mostraron una fibrosis pulmonar inducida por bleomicina significativamente reducida (27). Estas diferencias en la respuesta fibrótica a la bleomicina pueden atribuirse a la eliminación de genes incompleta versus completa.
Los efectos de PAR2 en la inflamación de las vías respiratorias y la patogénesis de la enfermedad pulmonar alérgica siguen sin estar claros. La evidencia conflictiva sugiere que la activación de PAR2 puede promover o proteger contra el desarrollo de la enfermedad pulmonar alérgica y la fibrosis de las vías respiratorias asociadas. Proponemos que estas discrepancias se pueden atribuir a variaciones en los sitios de activación de PAR2 o por diferencias en los modelos deficientes en PAR2. Como se mencionó anteriormente, PAR2 puede inducir respuestas celulares específicas de proteasa dependiendo del sitio de escisión de la proteasa (22, 28). También se ha demostrado que la funcionalidad del receptor puede persistir en modelos de eliminación incompletos (28, 29). En el estudio actual, evaluamos la exacerbación de la enfermedad pulmonar alérgica inducida por HDM por MWCNT en un modelo de ratón de mouse PAR2 modificado genéticamente. Presumimos que los ratones mutantes par2 en este estudio exhibirían diferentes respuestas patológicas en la exacerbación de la enfermedad pulmonar alérgica inducida por HDM por MWCNT en comparación con nuestro trabajo anterior con ratones PAR2 KO generados por la deleción de genes totales (6, 21). Similar a nuestros hallazgos anteriores con ratones par2 ko, …
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