Resumen
Este estudio introdujo un nuevo método de fijación dual para la vasculatura pulmonar y el tejido pulmonar en ratas hipertensión pulmonar (pH), abordando las limitaciones de los métodos de fijación tradicionales que no lograron preservar con precisión el estado in vivo de la morfología vascular pulmonar. El método modificado implicó un proceso de fijación dual, que combina soporte de ventilación individualizado y perfusión vascular para simular el movimiento respiratorio, la presión de la arteria pulmonar y la salida ventricular derecha de la rata en condiciones in vivo. Utilizando un modelo de rata de pH inducido por monocrotalina, este estudio comparó la fijación dual con la fijación de inmersión tradicional, centrándose en la evaluación cuantitativa del grado de expansión alveolar, la permeabilidad capilar, la cantidad de células endoteliales y el espesor de la pared de la vena pulmonar y la arteria. Los resultados demostraron que la fijación dual es superior para mantener la autenticidad e integridad del tejido pulmonar y más sensible en la evaluación de la hipertrofia de la arteria pulmonar, proporcionando una representación más confiable de la remodelación vascular pulmonar asociada con el pH.
Introducción
La hipertensión pulmonar (pH), caracterizada por la presión elevada de la arteria pulmonar y la resistencia vascular que conduce a la insuficiencia cardíaca derecha, representa un desafío grave en la investigación respiratoria y cardiovascular (1, 2). La morfología vascular pulmonar se evalúa necesariamente para reflejar directa y cuantitativamente la remodelación vascular pulmonar (3, 4). Sin embargo, la autenticidad de esta evaluación depende significativamente del método utilizado para la fijación del tejido pulmonar (5, 6).
Actualmente, los métodos de fijación del tejido pulmonar incluyen fijación de inmersión, fijación de perfusión intratraqueal, fijación de ligadura traqueal, perfusión vascular, fijación in situ, fijación de volumen fijo e inflación al vacío (5,6,7,8,9,10,11,12). La fijación de inmersión implica sumergir completamente el tejido pulmonar en un fijador para preservar la integridad de las células y la matriz extracelular (7). La fijación de perfusión intratraqueal fija el tejido pulmonar inyectando directamente el fijador en la tráquea, lo que permite que el fijador se distribuya uniformemente por los alvéolos y el tejido pulmonar, manteniendo efectivamente la estructura y la morfología del pulmón ((6, 8). La fijación de ligadura traqueal implica vincular la tráquea e introducir directamente el fijador en los pulmones a través de la tráquea, lo que es especialmente efectivo para mantener el estado de expansión natural de los pulmones y la estructura microscópica en comparación con la fijación de perfusión intratraqueal (6). La perfusión vascular introduce el fijador a través del sistema vascular del animal para lograr una fijación de tejido rápida y uniforme, pero es menos propicio para preservar la integridad estructural y las características morfológicas de las vías respiratorias y alvéolos (5, 6). La fijación in situ se refiere a fijar el tejido en su posición original, con el fijador administrado directamente a los pulmones a través de la tráquea para preservar mejor el estado natural del tejido pulmonar y la estructura microscópica (5, 9, 11). En el método de fijación de volumen fijo, el tejido pulmonar se fija dentro de un volumen preestablecido para ayudar a mantener la forma y el tamaño originales del tejido (5, 10). La inflación del vacío coloca el tejido pulmonar en un entorno de vacío y luego introduce lentamente fijador o aire en los pulmones para simular el estado de expansión natural de los pulmones, manteniendo la estructura de alvéolos y bronquiolos ((5, 12). Sin embargo, hasta ahora, no hay un método de fijación diseñado específicamente para preservar la morfología de la vasculatura pulmonar y el tejido circundante, incluidas las vías respiratorias y los alvéolos, proporcionando una visualización y evaluación más precisa y realista de las alteraciones de la morfología vascular pulmonar o la reembolso asociado con el pH.
En este estudio, exploramos un método modificado que involucra un proceso de fijación dual para la vasculatura pulmonar y las vías respiratorias. Utilizamos monocrotalina (MCT) para inducir pH en ratas Sprague-Dawley (SD) (13), y comparó la doble fijación con la fijación de inmersión tradicional o simple en la integridad del tejido pulmonar y la estructura de la vasculatura pulmonar. Los resultados indicaron que el método de fijación dual conserva de manera más efectiva la estructura in vivo del tejido pulmonar, particularmente la autenticidad e integridad de la morfología vascular pulmonar, lo que permite un análisis morfológico detallado y una descripción más confiable de las alteraciones patológicas del pH.
Materiales y métodos
Aprobación de ética y vivienda de animales
Este estudio involucró un total de 24 ratas Sprague-Dawley, de 7 a 8 semanas, con una distribución igual de hombres y mujeres, cada una con un peso de aproximadamente 200 g. Estos animales fueron aprobados para su uso por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong. Las ratas se alojaron tres por jaula en un recinto de 0.3 m3 y se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con acceso ad libitum a la comida y agua de laboratorio estándar. La ropa de cama consistió en virutas de madera autoclave a alta temperatura, que se cambiaron dos veces por semana. La fuente de ratas fue Hunan Slaque Jingda Laboratory Animal Co., Ltd., Nivel SPF. Las ratas se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de 40 mg/kg de pentobarbital de sodio (solución al 1%).
Modelo de hipertensión pulmonar y mediciones hemodinámicas
Los animales experimentales se dividieron al azar en cuatro grupos, seis animales por grupo, divididos uniformemente entre hombres y hembras. Dos grupos recibieron inyecciones intraperitoneales de monocrotalina (MCT) a una dosis de 60 mg/kg para establecer el grupo modelo (grupo MCT) como se describe en estudios anteriores (13, 14) incluyendo el nuestro (14), mientras que los otros dos grupos recibieron inyecciones intraperitoneales de solución salina para servir como grupo de control (grupo de control). Veintiún días después, la hemodinámica pulmonar que incluye la presión arterial pulmonar media (MPAP), el gasto cardíaco y la presión de circulación sistémica se midieron utilizando un catéter PE-50 y una sonda termoensible para el gasto cardíaco, conectado a un sistema de adquisición de señal de powerlab como se informó completamente en nuestros estudios anteriores (((((15,16,17,18).
Mediciones de hipertrofia ventricular derecha
Los tejidos del corazón se recogieron para recortar, se midió el peso de la pared ventricular derecha (RV) y la pared ventricular izquierda y el tabique (LV + S). La hipertrofia ventricular derecha se calculó como RV/(LV + S) (15,16,17,18).
Fijación tradicional de la fijación del tejido pulmonar solamente
Después de las mediciones hemodinámicas pulmonares, las ratas se transfirieron a la mesa de operaciones, donde la cavidad torácica estaba completamente expuesta. Se realizó una incisión en la aurícula izquierda usando tijeras oftálmicas y la vena cava superior e inferior se sujetó. Se insertó una jeringa de 50 ml con una aguja de infusión con un diámetro de 0,6 mm en la pared ventricular derecha hacia la arteria pulmonar, y la solución salina se infundió lentamente hasta que no fluía sangre desde la aurícula izquierda. Luego se retiraron los pulmones izquierdo y derecho, se colocaron en papel de filtro para borrar el exceso de líquido y posteriormente se sumergieron en paraformaldehído al 4% durante 24 h de fijación antes de ser incrustado en parafina (7).
Fijación de tejido pulmonar modificado fijación dual en pulmón ventilado y perfundido
Después de completar las mediciones hemodinámicas pulmonares, la rata se trasladó a la tabla de operaciones y los parámetros de un ventilador (Physiosuite, PS5677, Kent, EE. UU.) Se preestablecieron de acuerdo con el peso de la rata. Además, se preparó una solución salina de 500 ml en una botella de infusión con una aguja de infusión con un diámetro de 0,6 mm. La botella de infusión se colocó a la altura del nivel de líquido en el goteo de infusión de la siguiente manera: la altura (H) desde el nivel de líquido en el goteo hasta el corazón de la rata (CMH2O) = 1.36 × MPAP (MMHG) (Figura. S1). Por lo tanto, la presión de perfusión vascular se ajustó al nivel equivalente a la presión de la arteria pulmonar, el caudal se ajustó al nivel equivalente a la salida. El propósito de los ajustes anteriores fue simular el estado de perfusión vascular pulmonar en ratas intactas para cada una. La tráquea se aisló y se realizó una incisión en forma de «V» justo debajo del cartílago laríngeo utilizando tijeras oftálmicas, seguidas de intubación traqueal y conexión con el ventilador. Cuando la velocidad respiratoria coincidía con la frecuencia de la configuración de la forma de onda del ventilador, la cavidad torácica se expuso y se realizó una incisión en el apéndice auricular izquierdo. La vena cava superior e inferior se sujetó, y se insertó una aguja de infusión en la pared ventricular derecha y se colocó en la arteria pulmonar, luego se usó un hemostato para asegurar la aguja en su lugar. La perfusión vascular se realizó utilizando la configuración anterior hasta que ninguna sangre fluyó fuera de la incisión auricular izquierda. La botella de infusión se reemplazó luego con otra que contenía paraformaldehído al 4%, manteniendo la misma altura y velocidad de perfusión durante 2 minutos para fijar los vasos pulmonares en las mismas condiciones que simulan individualmente la presión de la arteria pulmonar y el gasto cardíaco en ratas intactas para cada uno. Se retiró el tubo traqueal, y el paraformaldehído al 4% se dejó caer lentamente en la tráquea hasta que se desbordó, la tráquea y ambos hilos pulmonares se ligaron rápidamente para evitar el colapso de las vías respiratorias posteriores a la disección. Los pulmones intactos izquierdo y derecho se sumergieron en paraformaldehído al 4% durante 24 h de fijación antes de la incrustación de parafina y la tinción de hematoxilina y eosina.
Intercepción lineal media alveolar (LM)
Para cada uno de los seis animales en un grupo, se preparó uno que se desliza o sección. De cada tobogán, se eligieron cuatro campos de aumento de 40 × (286 μm × 158 μm para cada uno) sin grandes vasos sanguíneos y vías respiratorias. Usando Photoshop, se superpuso una cuadrícula de 65 de las líneas de prueba horizontales (d). El lado izquierdo sirvió como punto de conteo, con el número de puntos en el extremo izquierdo de la cavidad alveolar (P) y el número de intersecciones entre las líneas de prueba y los septos alveolares (i) que se cuentan. LM fue calculado …
(Tagstotranslate) Fijación del tejido pulmonar (T) Hipertensión pulmonar (T) Morfología vascular pulmonar (T) Sistema de neumología/respiratoria
