Resumen
Antecedentes
La hipertensión pulmonar (HPH) inducida por hipoxia es un subgrupo de hipertensión pulmonar tipo 3 que puede causar falla ventricular derecha temprana y eventual insuficiencia cardíaca, que carece de posibles objetivos terapéuticos. Nuestra investigación previa demostró que las células Folicular Helper (TFH) que producen IL-21 estaban involucradas en HPH. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la patogénesis de HPH mediada por TFH/IL-21 han sido difíciles de alcanzar. Aquí investigamos el papel de las células TFH e IL-21 en HPH.
Métodos
Los estudios se realizaron en ratones C57BL/6 o ratones knockout IL-21 expuestos a hipoxia crónica para inducir el pH y examinados por hemodinámica. Los estudios moleculares y celulares se realizaron en las células pulmonares de ratón y el músculo liso arterial pulmonar (PASMC). Gen de la firma M2 (Fizz1), genes de firma M1 (iL-12β y MMP9), células BC B y su marcador GL-7, caspasa-1, macrófagos M2, células TFH, Bcl-6 e IL-21 se midieron . La tasa de proliferación de PASMC se midió por EDU. La piroptosis se evaluó utilizando la tinción con doble fluorescente Hoechst 33,342/Pi.
Resultados
En respuesta a la hipertensión pulmonar inducida por la exposición a la hipoxia crónica, los ratones IL-21-/-o la regulación negativa de las células TFH en ratones WT desarrollaron hipertensión pulmonar roma, remodelación vascular pulmonar atenuada. Además, la exposición a la hipoxia crónica aumentó significativamente las respuestas de células B del Centro Germinal (GC), que no estaban presentes en ratones IL-21-/-o regulación negativa de las células TFH en ratones WT. Es importante destacar que IL-21 promovió la polarización de los macrófagos alveolares primarios hacia el fenotipo M2. Consistentemente, se detectaron una expresión significativamente mejorada del marcador de macrófagos M2 Fizz1 en el fluido de lavado broncoalveolar de ratones HPH. Además, los macrófagos alveolares que se habían cultivado con IL-21 promovieron la proliferación de PASMCS y la piroptosis in vitro, mientras que un antagonista selectivo de CX3CR1, AZD8797 (AZD) atenuó significativamente la proliferación y piroptosis de los PASMC. Finalmente, la eliminación de ECM1 promovió la señalización de IL-2-STAT5 e inhibió la señalización de Bcl-6 para inhibir la diferenciación de TFH en HPH.
Conclusiones
Remodelación vascular pulmonar del eje TFH/IL-21 amplificada en HPH en HPH. Esto implicó polarización de macrófagos M2, proliferación de PASMCS y piroptosis. Estos datos sugirieron que el eje TFH/IL-21 puede ser un nuevo objetivo terapéutico para el tratamiento de HPH.
Introducción
La hipertensión pulmonar (pH), especialmente la hipertensión pulmonar inducida por hipoxia crónica (HPH), es una enfermedad debilitante caracterizada por un aumento sostenido y progresivo en la presión arterial pulmonar distal pequeña a mediana con cambios patológicos que implican espesamiento intimal concéntrico, muscularización arterial y vascular remodelación, lo que puede conducir a la insuficiencia cardíaca correcta y, en última instancia, a la muerte (1). Mientras que la patogénesis del pH es multifactorial y complicada, se sabe que los principales procesos conducen a la remodelación arterial pulmonar, incluida la desregulación inmune, la hiperplasia de las células del músculo liso arterial pulmonar (PASMC) y la deposición de la matriz extracelular (ECM) (ECM) (2). Las células inmunes como las células T y las células B acumularon las lesiones plexiformes en pacientes con pH avanzado, que reconocieron como contribuyentes cruciales a la patogénesis del pH (3). Además, las citocinas proinflamatorias secretadas por estas células inmunes pueden ser responsables de la proliferación de PASMC en el pH (4).
Se observó un papel potencial para las células inmunes, específicamente las células T en el pH hace más de 30 años, pero aún estamos lejos de comprender los subconjuntos de células inmunes cruciales y las vías de señal que conducen a la remodelación vascular pulmonar en el pH. En 1990, Duke et al. demostró que las subpoblaciones de linfocitos T y B se acumulan en la linfa pulmonar y el tejido durante los períodos de pH y pueden participar en la lesión pulmonar inducida por endotoxinas (5). El subconjunto específico de las células T CD4+ que proporciona ayuda a la reacción del Centro Germinal (GC) son las células de Helper folicular (TFH) que producen principalmente IL-21 (6). Muchos estudios han demostrado que la desregulación de las células TFH estuvo involucrada en muchos procesos patogénicos de enfermedades autoinmunes, como el síndrome de Sjögren, la esclerosis múltiple y el lupus eritematoso sistémico (7,8,9). Anteriormente, se informó que el agotamiento del factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) de las células T CD4+ redujo la frecuencia de las células TFH, lo que sugiere que la respuesta de la hipoxia promovió la diferenciación de TFH ((10). Recientemente, nuestro laboratorio informó que el porcentaje de células TFH aumentó significativamente en los ratones HPH que los del grupo de control, pero los mecanismos subyacentes de las células TFH en HPH siguen siendo difíciles de alcanzar (11). En un trabajo previo, la polarización y el reclutamiento de los macrófagos M2 se asociaron con el desarrollo de la proliferación de PASMCS in vitro y la remodelación vascular pulmonar in vivo de HPH (12).
Sin embargo, el papel de las células TFH en el desarrollo de HPH en asociación con polarización de macrófagos M2 y remodelación vascular pulmonar sigue siendo desconocido. Según estos hallazgos, planteamos la hipótesis de que las células TFH y la citocina IL-21 pueden contribuir al desarrollo de HPH al promover la polarización del macrófago M2. Este estudio identificó un papel crucial para las células TFH como mediadores de la remodelación vascular pulmonar en HPH.
Métodos
Animales y tratamiento in vivo
Los ratones C57BL/6 machos adultos (pesos corporales 25–28 g) se compraron de Hunan SilaiKejingda Laboratory Animal Co. Ltd., Changsha, China. Los ratones IL-21 Knockout (KO) (IL-21-/-) en el fondo C57BL/6 N se adquirieron de Cyagen Biosciences (stock no. KOCMP-60505-IL21-B6N-VA; Cyagen Biosciences, Guangzhou, China). Todos los animales se aclimataron durante una semana y se mantuvieron en una habitación controlada por temperatura y humedad con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, y recibieron alimentos estándar y agua purificada ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Laboratorio del Hospital Popular Provincial de Hunan (XSY-2021-42). Todos los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de control o vehículo/tratamiento, que se colocaron en una cámara que contenía 10% de O2 o bajo condición de normoxia durante 4 semanas. Para los experimentos de transferencia adoptiva in vivo, las células TFH se aislaron y se clasificaron de ratones expuestos a hipoxia durante 4 semanas. En resumen, las ingenuas células T CD4+ se aislaron y clasificaron utilizando kits de aislamiento de células T CD4+ (Miltenyi Biotec, Alemania) de ratones bazo de acuerdo con los protocolos del fabricante. Después de la clasificación, las células T CD4+purificadas se incubaron consecutivamente con el anticuerpo anti-CXCR5 conjugado con APC, el anticuerpo anti-PD-1 conjugado con PE (Ebiosiciencia) y las microperlas anti-APC (Miltenyi Biotec, Alemania) a aislar CD4+CXCR5+PD– 1+células TFH. Los ratones experimentales se administraron por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 1 × 106 células TFH en el día 1, 8, 15 y 22, y sus compañeros de camada se inyectaron con solución salina normal como controles. For the TFH cell inhibitor group, Bcl-6 inhibitor 79 − 6 (Millipore, USA) was dissolved in 10% dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma) and intraperitoneally injected (50 mg/kg body weight) every other day from the start of the Segunda semana hasta el final del experimento. El grupo de control y el grupo HPH se inyectaron con igual volumen de vehículo (10% DMSO) cada dos días. Para los estudios de silenciamiento in vivo de ECM1, los vectores de virus adenoasociados (AAV) que contenían Shecm1 fueron sintetizados y empaquetados por GenePharma (Shanghai, China). Después de la exposición a la hipoxia, se inyectó un total de 150 µl de AAV-SHNC o AAV-SHECM1 por instilación intratraqueal a una dosis diaria de 50 µl durante 3 días. La secuencia dirigida a ECM1 fue 5′-CTTTCAAGATTCAAGAGATCTTGAAAGTGCTCTGGCCTC-3 ‘.
Medición hemodinámica y análisis histológico
Después de 4 semanas, se midieron la hemodinámica pulmonar (presión media de la arteria pulmonar, MPAP) como lo describimos anteriormente. Brevemente, los animales fueron anestesiados y se insertó un catéter de polietileno lleno de heparina en el ventrículo derecho (RV) y se conectó a la grabadora fisiológica múltiple (Sistema Biopac, EE. UU.). Luego, el catéter se introdujo en la arteria pulmonar guiada por una curva de presión y se midió la presión arterial pulmonar. En el momento del sacrificio, los animales se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de sodio pentobarbital al 3% (30 mg/kg), la profundidad de anestesia se controló con reflejo del pedal. Todos los animales fueron anestesiados por inyección intraperitoneal de sodio pentobarbital y luego se sacrificaron por exsanguinación bajo anestesia, el método de eutanasia utilizado para todos los procedimientos animales. Se recogieron muestras de tejidos pulmonares, bazo, corazón, sangre periférica y pequeñas arterias intrapulmonares para su posterior análisis. El corazón se disecó en RV, tabique ventricular (VS) y ventrículo izquierdo (LV), se secó y pesó. El índice de hipertrofia ventricular derecho se calculó mediante la relación de RV a LV más el tabique (RV/(LV + S)). Los tejidos pulmonares se extirparon y se sumergieron en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ℃ para la fijación. Los tejidos pulmonar fijos se deshidrataron e incrustaron en parafina, luego se cortaron en secciones de 4 μm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Los cambios patológicos en las secciones de tejido pulmonar se examinaron con un microscopio óptico (Olympus, Japón). Se evaluaron los parámetros de hipertrofia vascular del grosor de medios de arteriolos pulmonares (PAMT) mediante la relación de espesor medial × 2 al diámetro externo.
Análisis de transferencia Western
La transferencia Western se realizó en fluido de lavado broncoalveolar aislado (BALF) para detectar Fizz1. La proteína BALF se extrajo utilizando tampón de lisis, y las concentraciones de proteína se midieron usando el ensayo de proteína Lowry. Se cargaron cantidades iguales de proteína de cada muestra en electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE) y se transfirieron a la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon en leche descremada al 5% y se incubaron con el anticuerpo primario Fizz1 (AB39626, Abcam, 1: 1000), BCL-6 (AB272859, …
(Tagstotranslate) T Folicular Helper Cell (T) M2 Macrófagos (T) Remodelación vascular pulmonar (T) Hipoxia (T) Hipertensión pulmonar (T) Sistema de neumología/respiratorio
