Resumen
Antecedentes
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) se caracteriza por fenotipos epiteliales pulmonares aberrantes, activación de fibroblastos y aumento del depósito de matriz extracelular. La señalización de Smad inducida por el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) 1 y la regulación negativa de los genes peroxisomales están involucradas en la patogénesis y pueden inhibirse mediante la activación del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPAR) -α. Sin embargo, se sabe que los tres PPAR, es decir, PPAR-α, PPAR-β/δ y PPAR-γ, interactúan en una diafonía compleja.
Métodos
Para imitar la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos pulmonares primarios de pacientes de control y de FPI con niveles comparables de los tres PPAR se trataron con TGF-β1 durante 24 h, seguido de la adición de ligandos de PPAR solos o en combinación durante otras 24 h. Se analizaron marcadores de fibrosis (niveles de colágeno intra y extracelular, expresión y actividad de metaloproteinasas de la matriz) y biogénesis y metabolismo peroxisomal (expresión genética de la biogénesis peroxisomal y proteínas de la matriz, niveles de proteína de PEX13 y catalasa, perfiles lipidómicos dirigidos y no dirigidos) después de TGF- Se investigaron el tratamiento con β1 y los efectos de los ligandos de PPAR.
Resultados
TGF-β1 indujo el fenotipo esperado; por ejemplo, aumentó los niveles de colágeno intra y extracelular y disminuyó la biogénesis y el metabolismo peroxisomal. Los agonistas de diferentes PPAR revirtieron la fibrosis inducida por TGF-β1 incluso cuando se administraron 24 h después de TGF-β1. Los efectos incluyeron la reversión de (1) el aumento en la producción de colágeno al reprimir la actividad del promotor COL1A2 (a través de la activación de PPAR-β/δ); (2) la actividad reducida de las metaloproteinasas de matriz (mediante la activación de PPAR-β/δ); (3) la disminución de la biogénesis peroxisomal y el metabolismo de los lípidos (mediante la activación de PPAR-γ); y (4) la disminución de los niveles de proteína catalasa en los fibroblastos de control (mediante la activación de PPAR-γ) y FPI (mediante una activación combinada de PPAR-β/δ y PPAR-γ). Otros experimentos para explorar el papel de la catalasa mostraron que una sobreexpresión de la proteína catalasa reducía la producción de colágeno. Además, el efecto beneficioso de PPAR-γ pero no de la activación de PPAR-β/δ sobre la síntesis de colágeno dependía de la actividad catalasa y, por tanto, era sensible al redox.
Conclusión
Nuestros datos proporcionan evidencia de que los pacientes con FPI pueden beneficiarse de una activación combinada de PPAR-β/δ y PPAR-γ.
Fondo
La FPI es una enfermedad pulmonar intersticial restrictiva grave con una mediana de supervivencia del paciente de 2,5 a 3,5 años (1). Con respecto a la patogénesis de la FPI, se está discutiendo que una respuesta excesiva a la lesión da como resultado una sobreproducción persistente de componentes de la matriz extracelular (MEC) por parte de fibroblastos activados y en proliferación. Además, el estrés oxidativo sigue siendo un mecanismo importante asociado con la progresión de esta enfermedad (2). Hoy en día, sólo están disponibles opciones de tratamiento limitadas para la FPI. Las recomendaciones basadas en evidencia para el manejo farmacológico de la enfermedad son el inhibidor de la tirosina quinasa nintedanib (3, 4) y pirfenidona (4, 5), un inhibidor de la síntesis de colágeno estimulada por TGF-β1. Ambos fármacos aumentan la calidad de vida, atenúan los síntomas y ralentizan la progresión de la FPI, pero sólo nintedanib influye en la mortalidad. Algunos de los nuevos medicamentos se dirigieron a la pentraxina (implicada en la reparación del tejido endógeno), el ácido lisofosfatídico o el factor de crecimiento del tejido conectivo (media la señalización posterior del TGF-β1), pero no alcanzaron los criterios de valoración clínicos.6, 7). Otras sustancias en proceso son el nerandomilast (un inhibidor de la tirosina quinasa), que completó con éxito los ensayos clínicos de fase II (8) y treprostinil inhalado, un análogo de la prostaciclina. Treprostinil mostró efectos beneficiosos en el ensayo INCREASE inicial (9) y estudio TETON en curso (10) y mientras tanto ha sido aprobado para el tratamiento de la hipertensión pulmonar del grupo 1 de la OMS con un impacto positivo adicional en la FPI. Sin embargo, todavía se requiere una investigación exhaustiva para desarrollar nuevas modalidades terapéuticas.
Para encontrar intervenciones terapéuticas para la FPI, varios estudios exploraron los potenciales antifibróticos de los ligandos PPAR naturales y sintéticos. Por ejemplo, se demostró que la activación de PPAR-α atenúa la fibrosis en el hígado (11), corazón (12) y pulmón (13, 14), mientras que los agonistas de PPAR-β exhibieron efectos antiproliferativos (15), pero aumentó la secreción de TGF-β1 y ECM (16). Los ligandos de PPAR-γ son los más prometedores (17,18,19,20) y se pensaba que inhibían la transdiferenciación de fibroblastos (21, 22) y para fortalecer el sistema de defensa antioxidante (23). Además, los agonistas pan-PPAR, como el lanifibranor (24) e IVA337 (25) fibrosis atenuada. Sin embargo, en todos estos estudios, el mecanismo antifibrótico de los agonistas de PPAR no quedó claro y se suponía que se debía principalmente a sus actividades antiinflamatorias.26). Otro inconveniente fue el cronograma del tratamiento farmacológico. Normalmente, los fármacos se añadían antes o junto con el TGF-β1, pero estos enfoques no reflejan la situación del paciente en el que los fármacos sólo se pueden administrar después del diagnóstico de la enfermedad, años después de su inicio. En dos estudios, se aplicaron agonistas de PPAR-γ después de una lesión pulmonar inducida por bleomiina en ratones. Zeng et al. (27) agregaron el ligando PPARγ asarinina 15 a 28 días después de la administración de bleomicina, lo que redujo la gravedad de la fibrosis. Speca et al. (22) aplicaron GED-0507, un modulador de PPARγ con fuertes efectos antiinflamatorios, a ratones el día 14 después de la administración de bleomicina y reportaron resolución de la fibrosis con una tasa de mortalidad del 50%. Este programa posterior al tratamiento redujo la deposición de colágeno, pero en menor medida que el enfoque de prevención utilizado en el mismo estudio. Por tanto, pensamos que un postratamiento con una combinación de ligandos de PPAR podría aumentar aún más el efecto antifibrótico. Además, nuestro objetivo era utilizar un modelo humano y fibroblastos humanos cultivados, ya que este último modelo in vitro garantiza mejor la disponibilidad del fármaco y permite un análisis selectivo (bioquímico) de los cambios en los fibroblastos, los principales actores de la fibrosis.
En este estudio, investigamos si la activación de cada uno de los tres PPAR solos o en varias combinaciones influyó en la síntesis de colágeno y la liberación de fibroblastos pulmonares de pacientes control y con FPI cuando se les administró 24 h después de TGF-β1, el estimulador endógeno de la fibrosis. Además, intentamos explorar el mecanismo del efecto antifibrótico de los agonistas de PPAR analizando los cambios en los miembros de las metaloproteinasas de matriz (MMP) (28), biogénesis y metabolismo de peroxisomas (13, 14), y el nivel de proteína y la actividad de la catalasa, la principal enzima antioxidante en los peroxisomas (29) con los números de rotación más altos de todas las enzimas (30).
Métodos
Aprobación del estudio
La recolección de muestras biológicas (es decir, tejidos pulmonares y fibroblastos de donantes de órganos) fue aprobada por el Comité de Ética de la Universidad Justus Liebig de Giessen (Az58/15 y Az111/08, JLU).
Cultivo celular y tratamiento farmacológico.
Los fibroblastos pulmonares de pacientes control y con FPI (archivo adicional: Tabla S1) y líneas celulares de fibroblastos deficientes en catalasa se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con penicilina/estreptomicina o puromicina, respectivamente. Para los experimentos, las células fueron privadas de suero durante 3 h, estimuladas con vehículo o rhTGF-β1 durante 24 h (excepto las Figs. 2B, C, E, 3B), seguido de la adición de vehículo o fármacos solos o en combinaciones durante otras 24 h.
Derribo de catalasa en fibroblastos de pulmón humano
La eliminación de la catalasa se realizó con CAT siRNA utilizando el reactivo de transfección ScreenFectA. La eliminación estable de la catalasa se logró mediante la transducción con vectores de lentivirus de control pGIPZ-shCatalase y pGIPZ-no silenciador como se describió anteriormente (31).
Sobreexpresión de catalasa en fibroblastos de pulmón humano.
La transfección con el plásmido de sobreexpresión de catalasa (pGL 4.14-Catalase) y los plásmidos indicadores promotores COL1A2-luc y el elemento de respuesta PPAR (PPRE) -luc se realizaron como se describió anteriormente (13, 32). Los datos del vector pRL-SV40 sirvieron para normalizar los resultados del plásmido indicador de luciferasa.
Inmunoensayo de TGF-β1 humano y ensayo de colágeno sircol
Los medios de cultivo recolectados de control y fibroblastos de IPF se usaron para los ensayos de colágeno Sircol y el ensayo ELISA de TGF-β1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Mediciones de actividad catalasa, producción de peróxido de hidrógeno (H2O2) y proliferación celular.
Determinación de la actividad catalasa con un kit de ensayo de colorante redox basado en la degradación de H2O2. El H2O2 producido por las células cultivadas se cuantificó utilizando un kit de detección fluorométrica. La incorporación de BrdU en células en proliferación se detectó con un kit ELISA. Para todos los kits mencionados anteriormente, seguimos las instrucciones de los fabricantes.
transferencia Western
Las proteínas de los lisados celulares totales se separaron en geles de SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron en membranas de difluoruro de polivinilideno. Se detectaron proteínas específicas utilizando anticuerpos primarios y secundarios marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP), seguido de una detección quimioluminiscente del sustrato de HRP. ImageJ se utilizó para el análisis semicuantitativo de las intensidades de la señal.
Tinción de inmunofluorescencia
Se incubaron secciones delgadas de tejidos pulmonares incluidos en parafina con anticuerpos marcados con fluoróforos primarios y secundarios. Las imágenes de inmunofluorescencia se adquirieron mediante microscopía de barrido láser confocal.
Aislamiento de ARN total y RT-qPCR.
El ARN total se aisló utilizando RNAzol y los niveles de ARNm se analizaron mediante RT-qPCR.
Cuantificación dirigida de ácidos grasos.
El ácido araquidónico (AA), el ácido docosahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentaenoico (EPA) se analizaron en el medio de cultivo mediante extracción en fase sólida y un enfoque de cromatografía líquida específica en tándem de espectrometría de masas (LC-MS/MS) como se describió anteriormente (32).
Lipidómica no dirigida
Los lípidos se extrajeron de los lisados celulares utilizando un protocolo de extracción bifásico de metil-terc-butil éter (MTBE) (33) y analizado utilizando un método LC-MS/MS no dirigido como se describió anteriormente (34).
Estadística
El análisis se realizó utilizando el software GraphPad Prism. Los datos se expresaron como…
