Harmine alivia la lesión pulmonar aguda inducida por LPS al inhibir la vía de señalización MAPK/NF-κB mediada por CSF3

Resumen

Antecedentes

La lesión pulmonar aguda (ALI) es una enfermedad pulmonar inflamatoria potencialmente mortal que carece de estrategias de tratamiento seguras y efectivas. Harmine, un alcaloide derivado de las plantas de Peganum Harmala L, exhibe actividad antiinflamatoria. Sin embargo, el efecto protector de Harmine contra Ali y su mecanismo subyacente sigue siendo desconocido. Este estudio tuvo como objetivo dilucidar los efectos terapéuticos y los mecanismos moleculares de Harmine contra ALI.

Métodos

Los efectos terapéuticos de Harmine se evaluaron en ratones ALI inducidos por LPS. El líquido de lavado de suero, broncoalveolar (BALF), los tejidos pulmonares se analizaron de manera rutinaria para evaluar la gravedad de la enfermedad. El mecanismo antiinflamatorio se dilucidó en las células RAW264.7 simuladas por LPS utilizando un ensayos en serie, que incluyen ARN-seq, silenciamiento génico, inmunofluorescencia, transferencia Western, coinmunoprecipitación y análisis bioinformático. La seguridad biológica de Harmine se determinó tanto in vitro como in vivo a través de la prueba de citotoxicidad, prueba de proliferación celular a largo plazo, prueba de toxicidad aguda en ratones y evaluaciones de la función hepática y renal y los cambios estructurales.

Resultados

Los resultados mostraron que Harmine inhibió la expresión y la secreción de factores inflamatorios inducidos por LPS (IL-6, IL-1β y TNF-α) y una reducción de la infiltración de células inflamatorias en los pulmones, lo que resulta en cambios histopatológicos e inducidos por LPS aliviados en ratones. Mecánicamente, los hallazgos revelaron que Harmine no interrumpe la interacción TLR4-MD2, sino que atenúa la inflamación al suprimir la transcripción y la expresión de CSF3, lo que lleva a la inhibición de la activación de la vía de señalización MAPK/NF-κB inducida por la estimulación de LPS. Además, los estudios in vitro e in vivo demostraron que la administración de Harmine no exhibe citotoxicidad obvia o inhibición de la proliferación celular a largo plazo, ni causa lesiones funcionales u orgánicas el hígado y el riñón en ratones u otros efectos tóxicos agudos.

Conclusiones

Estos hallazgos aclararon que la actividad antiinflamatoria de Harmine se logró mediante la inactivación mediada por CSF3 de la vía de señalización MAPK/NF-κB, lo que sugiere que Harmine podría servir como un medicamento terapéutico prometedor para ALI y otras enfermedades inflamatorias.

Fondo

La lesión pulmonar aguda (ALI) es una enfermedad pulmonar inflamatoria potencialmente mortal causada por el daño a las células epiteliales alveolares y las células endoteliales capilares (1, 2). Hasta el 50% de los pacientes con Ali con infección severa desarrollarán el Síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), lo que resulta en una tasa de mortalidad de hasta el 46% incluso con el tratamiento estándar (3,4,5). La patogénesis de ALI es la inflamación compleja y sistémica conduce a complicaciones graves, lo que hace que el tratamiento clínico sea desafiante incluso en entornos médicos avanzados (6). La ventilación mecánica, el manejo de líquidos y los tratamientos de apoyo basados ​​en la terapia con drogas, siguen siendo las principales estrategias clínicas para ALI (7). Sin embargo, estos tratamientos a menudo no cumplen con las expectativas clínicas debido a los inconvenientes como inducir edema pulmonar y barotrauma, inmunosupresión y resistencia a los medicamentos, incluso una resistencia a los medicamentos múltiples. Aunque algunos tratamientos nuevos están disponibles para pacientes con ALI (2, 8), estas estrategias recientemente desarrolladas, como la oxigenación de la membrana extracorpórea (ECMO), son costosas y complicadas de administrar (9). En consecuencia, la terapia de apoyo aún se adopta generalmente para aliviar a los pacientes que padecen ALI, aunque tiene un efecto positivo limitado en la supervivencia. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos objetivos, posibles drogas terapéuticas y estrategias de tratamiento para ALI es urgente.

Las vías de señalización MAPK y NF-κB, que interactúan sinérgicamente para regular el alcance y la duración de la respuesta inflamatoria, juegan un papel crítico en la tormenta inflamatoria en ALI ((10, 11). Actualmente, el tratamiento antiinflamatorio de ALI ha logrado el efecto terapéutico esperado principalmente al regular estas vías (12,13,14). CSF3, también conocido como factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), es una citocina que juega un papel importante en la regulación de la inflamación y la respuesta inmune (15,16,17). Se había demostrado que CSF3 regula las vías de señalización MAPK y/o NF-κB (18,19,20). Por ejemplo, CSF3 alivió los defectos vasculares cerebrales inducidos por la diabetes activando la vía de señalización MAPK (21), mejora los comportamientos similares a la depresión al inhibir las vías de señalización de MAPK (22), e inhibe las actividades de MAPK en la diferenciación de neutrófilos dependientes de CSF3 (23). Además, CSF3 promueve la autofagia de las células neuronales al inhibir la vía de la señal NF-κB en un modelo de ratones de lesión de la médula espinal aguda (24), y exhibe una correlación positiva con los niveles de proteína NF-κB en el hipocampo de ratones (25). En general, los estudios previos demuestran una asociación regulatoria cercana entre CSF3 y las vías de señalización MAPK o NF-κB en enfermedades no inflamatorias. Además, CSF3 también actúa como un mediador inflamatorio potencial en Balf y Suero (26), y puede inducir ali en ratas (27, 28). Por lo tanto, CSF3 podría ser un nuevo objetivo valioso en el tratamiento de ALI, y aunque aún no se ha informado, garantiza una mayor exploración.

Harmine (Pubchem CID: 5280953, Fig. 1A), un alcaloide derivado de la planta natural Peganum Harmala L, posee múltiples actividades farmacológicas, incluidos los efectos antitumorales antiinflamatorios, antibacterianos (29,30,31). La evidencia muestra que el daño puede inhibir la polarización del fenotipo M1 de los macrófagos RAW 264.7 y reducir la respuesta inflamatoria al inhibir la activación de las vías de señalización STAT1/3, NF-κB y MAPK ((32). Además, el Harmine aumenta el nivel de factores antiinflamatorios al facilitar la polarización de los macrófagos del fenotipo M1 al M2, que juega un papel clave en la etapa tardía de la inflamación y expresa factores inflamatorios inhibitorios (33). Además, los estudios sugieren que Harmine alivia la lesión renal aguda inducida por LPS en ratones al inhibir la vía de señalización de inflamasoma TLR4-NF-κB/NLRP3 (34). Colectivamente, estudios previos sugieren que la Harmine puede tener un efecto terapéutico potencial sobre ALI al modular los procesos inflamatorios. Por lo tanto, para explorar el Harmine como un agente terapéutico potencial para ALI y enriquecer aún más su perfil farmacológico, su efecto terapéutico y su mecanismo subyacente se investigaron en un modelo de ratón ALI inducido por LPS y células RAW 264.7. Los resultados indican que Harmine alivia el ALI inducido por LPS en ratones al inhibir la vía MAPK/NF-κB al suprimir la transcripción y la expresión de CSF3.

Fig. 1

Harmine inhibió la inflamación inducida por LPS. (A) Diagrama de Venn del objetivo cruzado entre el objetivo terapéutico de Harmine y Ali. (B) Red PPI con 85 objetivos superpuestos, los nodos circulares coloreados representan objetivos relacionados con la inflamación. (do) Análisis de enriquecimiento de KEGG de los 85 genes superpuestos. (D) La viabilidad celular de la armina contra las células RAW264.7 en la dosis indicada. (mi) El ensayo QPCR determinó los niveles de ARNm de IL-6, IL-1β y TNF-α en células RAW264.7. Antes de usarse, las células se pretrataron con la dosis indicada de Harmine durante 30 minutos, seguido de la exposición a LPS (0.5 µg/ml) durante 6 h. (F) ELISA El ensayo determinó la secreción de la proteína IL-6, IL-1β y TNF-α. Las células fueron tratadas igual que (E), excepto LPS estimuladas durante 12 h. (GRAMO y H) El ensayo ELISA determinó el contenido de citocinas en BALF y suero de ratones ALI inducidos por LPS. (I) Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica en el tejido pulmonar. Barra de escala, 50 μm. (J–L) La transcripción de IL-6, IL-1β y TNF-α en el pulmón se determinó mediante QPCR. El modelo de ratón ALI inducido por LPS se estableció administrando LPS (5 mg/kg intratraqueal) a ratones C57BL/6 (n = 6) con o sin pretratado con una dimensura en la dosis indicada. Se recogieron tejidos pulmonares, BALF y suero 6 h después del modelado. Los valores representan la media ± DE de al menos tres experimentos independientes. ns, sin importancia; *p <0.05; ** p <0.01; *** P <0.001, **** P <0.0001, frente al grupo LPS. #### P <0.0001, vs. Grupo de control

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Materiales y métodos

Reactivos y anticuerpos

Harmine (Cat. No. 442-51-3) se obtuvo de Targetmol (Shanghai, China). Se obtuvo LPS (Cat. No. 325D031) de Solarbio. Anticuerpos contra β-actina (Cat. No. 13e5), P38 (Cat. No. 9212 s), P38 fosforilado (P-P38) (Cat. No. 9211 S), c-jun N-terminal quinasa (JNK; Cat. No. 9252 S), P-JNK (Cat. No. 4668 S), Signalus-Signase-Regulated Signase (Erk (Erk (Erk (Erk (Erk (Erk. 4695 s), P-ERK (Cat. No. 4695 S), NF-κB P65 (Cat. No. D14E12), P-P65 (Cat. No. 3033 S), IκBα (Cat. No. 4812 s), P-IκBα (Cat. No. 2859 S), lamina B1 (Cat. No. 13435 S), anti-Rabbit (No. 7074) IgG (No. 7076) fueron de la tecnología de señalización celular (Danvers, MA). Los anticuerpos contra TLR4 (Cat. No. SC-293072), MD2 (Cat. No. SC-80183), marcadores de macrófagos LY-6G (Cat. No. SC-53515) y F4/80 (Cat. No. SC-377009) se compraron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). El anticuerpo IL-6 (Cat. No. 26404-1-AP), TNF-α (Cat. No. 26405-1-AP) e IL-1β (Cat. No. 26048-1-AP) se obtuvieron de ProteIntech (Wuhan, China). Kit ELISA TNF-α de ratón (88-7324-86), el kit ELISA IL-1β de ratón (88-7013 A-88) y el kit ELISA de ratón IL-6 (88-7064-86) se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific (USA). El anti-conejo conjugado con dylight 488 (No. SA00013-2), para ensayos de inmunofluorescencia, se adquirió de ProteIntech (Wuhan, China). El kit de proliferación celular Beyoclick ™ EDU con Alexa Fluor 555 (No. C0075L) se obtuvo de Beyotime (Shanghai, China). El kit de ensayo de apoptosis anexina V-FITC (No. 556547) se adquirió de BD Biosciences (EE. UU.). El kit de ensayo de alanina aminotransferasa (ALT) (C009-2-1), el kit de ensayo de aspartato aminotransferasa (AST) (C010-1-1) y el kit de ensayo de creatinina (CR) (C011-2-1) se adquirieron en el Instituto de Bioenguinización de Jiancheng Jiancheng (Nanjing, China).

Administración de drogas

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