Resumen
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica irreversible y progresiva que afecta a millones de personas en todo el mundo. Se observa que los fibroblastos activados se acumulan en los pulmones de pacientes con EPOC y promueven la progresión de la EPOC a través del depósito aberrante de matriz extracelular (MEC). En este estudio, identificamos que la expresión de miR-1307-5p aumentó significativamente en los fibroblastos de pulmón derivados de pacientes con EPOC. Mecánicamente, encontramos que la regulación positiva de miR-1307-5p promovió la activación y transdiferenciación de fibroblastos pulmonares inducida por TGF-β. También identificamos FBXL16 como un objetivo directo para la activación de miofibroblastos mediada por miR-1307-5p en la EPOC. La eliminación de FBXL16 por ARNip aumentó de manera destacada la expresión de marcadores de miofibroblastos en fibroblastos MRC-5 después de la administración de TGF-β. La expresión ectópica de FBXL16 en MRC-5 contrarrestó la transdiferenciación de fibroblastos inducida por agomir miR-1307-5p. Además, encontramos que miR-1307-5p promovió la transdiferenciación de fibroblastos pulmonares a través de la degradación de HIF1α regulada por FBXL16. En general, nuestros hallazgos indican que miR-1307-5p es importante para la patogénesis de la EPOC y puede servir como un objetivo potencial para el tratamiento de la EPOC.
Introducción
La EPOC es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica irreversible y progresiva que afecta a millones de personas en todo el mundo, afectando especialmente a la población de edad avanzada debido a la disminución natural de la función pulmonar que se produce con la edad. La enfermedad se caracteriza por bronquitis crónica y enfisema (1, 2). Además del tabaquismo, que es el factor de riesgo más importante para la EPOC (el índice de tabaquismo se correlaciona positivamente con la gravedad de la EPOC), la contaminación del aire también desempeña un papel importante en el desarrollo de la EPOC. La exposición prolongada al aire contaminado puede provocar una respuesta inflamatoria persistente en los pulmones, lo que contribuye a la patogénesis de la EPOC. La alteración del epitelio de las vías respiratorias y la remodelación desregulada inducida por el tabaquismo se consideran fundamentales para la patogénesis de la EPOC. Un desequilibrio entre el depósito y la degradación de la MEC es uno de los principales mecanismos de remodelación de las vías respiratorias de la EPOC.3). La combinación del deterioro de la función pulmonar relacionado con la edad y los contaminantes ambientales crea un efecto sinérgico que puede exacerbar la afección.
La ECM desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la estructura y función normales de los pulmones. Es un mediador importante para proteger contra el daño del tejido pulmonar. Sin embargo, la síntesis excesiva y la acumulación de ECM en estados patológicos pueden tener un impacto directo en la estructura de las vías respiratorias, lo que lleva a una construcción estructural anormal de la pared de las vías respiratorias, destrucción del parénquima pulmonar e hiperplasia intersticial, exacerbando la fibrosis de las vías respiratorias y obstruyendo el flujo de aire de las vías respiratorias.4). Las principales fuentes de componentes de la ECM de las vías respiratorias son los fibroblastos y miofibroblastos pulmonares. La transdiferenciación de los fibroblastos pulmonares es crucial en el aumento de la acumulación de ECM y la remodelación de las vías respiratorias en la EPOC.5).
Los fibroblastos son células estructurales del pulmón cuya función principal es mantener el pulmón y reparar el daño (6). En respuesta a una lesión, los fibroblastos se diferencian y se activan como miofibroblastos con la ayuda de mediadores profibróticos como el TGF-β, y expresan un alto nivel de alfa actina del músculo liso (α-SMA). Estos fibroblastos liberan proteasas para escindir la ECM dañada y permitir el acceso a otras células y la deposición de nueva ECM. Los miofibroblastos también liberan citoquinas y quimiocinas para señalar y reclutar células inmunes y depositar ECM.7). Además, los fibroblastos activados poseen características contráctiles que ayudan en el proceso de cierre de la herida.8).
Si bien fisiológicamente los fibroblastos desempeñan un papel clave en la reparación pulmonar, si se vuelven disfuncionales, pueden promover una remodelación aberrante del tejido. En pacientes con EPOC, el epitelio de las vías respiratorias produce más TGF-β, lo que da como resultado un entorno profibrótico alrededor de las vías respiratorias que promueve la activación de los fibroblastos.9). En el tejido pulmonar de la EPOC, hay una acumulación de fibroblastos activados y una expresión elevada de α-SMA (10). Estos fibroblastos también tienen una expresión alterada de marcadores profibróticos, con evidencia de una mayor expresión de genes TGF-β y ECM, como COL1A1 y COL3A1, en comparación con los fibroblastos de control de fumadores/no fumadores.11). Esto sugiere que los fibroblastos son responsables del depósito desregulado de ECM y, por lo tanto, están implicados en el desarrollo de la EPOC.
Los microARN, también conocidos como miARN, son un tipo de ARN regulador no codificante de proteínas que tiene alrededor de 22 nucleótidos de longitud (12). Los miRNA se emparejan con los mRNA de acuerdo con el principio de complementariedad de bases e inhiben la traducción de los mRNA diana o promueven la degradación de los mRNA, reduciendo así los productos proteicos de los mRNA diana.13). Numerosos estudios han encontrado que los miARN están estrechamente relacionados con el desarrollo de la EPOC (14). MiR-1307-5p es funcionalmente un miARN menos estudiado. Se informó que se dirige a TRAF3 y activa la vía MAPK/NF-κB para promover la proliferación del adenocarcinoma de pulmón (15).
En nuestro estudio de cohorte anterior basado en la población de EPOC, encontramos que miR-1307-5p aumentaba en las muestras de sangre de pacientes con EPOC. En este estudio, identificamos que la mayoría de la expresión aumentada de miR-1307-5p se produjo en fibroblastos de pulmón. Mecánicamente, encontramos que la regulación positiva de miR-1307-5p promovía la activación de miofibroblastos pulmonares. También identificamos FBXL16 como un objetivo directo para la activación de miofibroblastos mediada por miR-1307-5p en la progresión de la EPOC. Además, determinamos que HIF1α media la activación de fibroblastos regulada por FBXL16. Nuestros hallazgos indican que miR-1307-5p es importante para la patogénesis de la EPOC y puede servir como un objetivo potencial para el tratamiento de la EPOC.
Materiales y métodos
Inducción de EPOC experimental.
Se adquirieron ratones C57BL/6 machos de ocho a diez semanas de edad de Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, China) y se alojaron en condiciones estériles con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, lo que permitió un período de aclimatación de una semana. Para inducir la EPOC experimental, los ratones fueron sometidos a una exposición crónica al humo de los cigarrillos Chinese Lion o al aire normal mediante inhalación nasal durante 75 minutos, dos veces al día, cinco días a la semana durante 16 semanas. Para la intervención con agomir de miARN, a los ratones se les administró por vía intranasal antagomir específico o revuelto de MiR-1307-5p una vez a la semana (2,5 mg/kg) bajo anestesia con isoflurano. Para la sobreexpresión de FBXL16 en tejidos pulmonares, a los ratones se les administró por vía intranasal un control o FBXL16 que expresaba AAV6 dos veces, en la cuarta y octava semana, bajo anestesia con isoflurano. Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo los protocolos aprobados por el Comité de Ética y Manejo de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de Hangzhou en la provincia de Zhejiang (número de licencia de permiso de uso de animales: SYXK 2023-0011, número de licencia de aprobación de ética y bienestar animal: ZJCLA-IACUC- 202387).
Evaluación de la función pulmonar
Las pruebas de función pulmonar se realizaron mediante un sistema de maniobra pulmonar forzada (Shanghai Yuyan Instrument Co., Ltd.), siguiendo las instrucciones del fabricante y los protocolos establecidos (16). Los ratones fueron anestesiados con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg), seguido de canulación traqueal. Cada maniobra se realizó tres veces y se calcularon los resultados promedio.
Sujetos humanos
Se obtuvieron muestras de tejido pulmonar normal y de EPOC de pacientes sometidos a lobectomía o neumonectomía por cáncer de pulmón en el Hospital Afiliado de Quzhou de la Universidad Médica de Wenzhou. La EPOC se diagnosticó basándose en una combinación de antecedentes médicos y examen físico, incluida una prueba de función pulmonar mediante espirometría. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Todos los estudios han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Afiliado de Quzhou de la Universidad Médica de Wenzhou (permiso n.º 2021-03-005). La información médica básica de los voluntarios se enumera en la tabla 1. Cada paciente firmó un formulario de consentimiento informado para la recolección de muestras.
Tabla 1 Características del paciente para el análisis de mir-1307-5pmesa de tamaño completocultivo celular
Las células de fibroblasto de pulmón humano MRC-5 y HEK293T se adquirieron del Banco de células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) y se cultivaron en DMEM que contenía 10 % de FBS y antibióticos en 5 % de CO2 a 37 ℃ en una atmósfera humidificada.
Aislamiento de fibroblastos pulmonares primarios y células epiteliales.
Los fibroblastos primarios de pulmón humano y las células epiteliales de pulmón se aislaron como se describió anteriormente (17). Los tejidos pulmonares se cortaron en trozos pequeños y se incubaron con tampón de digestión (colagenasa al 0,1%, tripsina al 0,05% y DNasa 100 mg/ml en solución salina equilibrada de Hanks) durante 1 hora a 37 ℃. Las suspensiones de tejido digerido se filtraron a través de un filtro celular de 40 µm, se centrifugaron a 500 xg durante 5 minutos y se recogieron los sedimentos. Después de la lisis de los glóbulos rojos, las células se resuspendieron y se incubaron durante 1 h con anticuerpos anti-CD16/32, anti-CD45 y anti-CD31 conjugados con biotina. Luego las células se enjuagaron, se resuspendieron y se incubaron durante 30 minutos con perlas magnéticas de estreptavidina. Luego, los tubos que contenían las células incubadas se aplicaron a un imán para agotar las células endoteliales, linfocitos, monocitos/macrófagos, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y otras células hematopoyéticas. Los sobrenadantes se recogieron y se sembraron en placas de cultivo de tejidos. Después de 1 h de incubación a 37 ℃, las células epiteliales pulmonares suspendidas se recolectaron para experimentos. Los fibroblastos de pulmón adherentes se cultivaron en medio MEM suplementado con FBS al 10%. Para los experimentos se utilizaron fibroblastos en los pases 3 a 5.
Plásmidos, transfección e infección lentiviral.
miR-1307-5p agomir (HY-R00240A) y antagomir (HY-RI00240A) se compraron en MedChemExpress LLC (Shanghai, China). En comparación con los imitadores/inhibidores comunes, el miARN agomir/antagomir tiene mayor estabilidad y efecto inhibidor en células de mamíferos, y es más probable que atraviese las membranas celulares para enriquecerse en las células diana. Las células fueron transfectadas…
