Resumen
Este estudio explora el papel y los mecanismos potenciales del microARN-125b-5p (miR-125b-5p) en la fibrosis pulmonar (PF). La PF es un resultado típico de muchas enfermedades pulmonares crónicas, con mal pronóstico y falta de tratamiento médico adecuado porque los mecanismos moleculares de la PF aún no se conocen bien. En este estudio, utilizando análisis in vitro e in vivo, encontramos que miR-125b-5p es probablemente un potente regulador de la fibrosis pulmonar. Los hallazgos revelan que, por un lado, miR-125b-5p no solo disminuye específicamente la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) de las células epiteliales pulmonares, sino que también muestra una tendencia a la regulación negativa en los tejidos pulmonares de ratones con PF. Por otro lado, la sobreexpresión de miR-125b-5p a nivel celular y animal regula a la baja la EMT y los fenotipos fibróticos, respectivamente. Para aclarar el mecanismo molecular del efecto «terapéutico» de miR-125b-5p, utilizamos la herramienta de predicción de objetivos combinada con un ensayo de luciferasa dual y completamos un experimento de rescate mediante la construcción del vector de sobreexpresión del antagonista homólogo de Bcl-2 del gen objetivo. Killer (BAK1), lo que confirma que miR-125b-5p puede inhibir eficazmente la EMT y el proceso de fibrosis al atacar el gen BAK1. MiR-125b-5p inhibe la EMT en las células epiteliales del pulmón al regular negativamente BAK1, mientras que la sobreexpresión de miR-125b-5p puede aliviar la fibrosis pulmonar. Los hallazgos sugieren que MiR-125b-5p/BAK1 puede servir como un posible objetivo de tratamiento para la PF.
Resumen gráfico
Introducción
La fibrosis pulmonar (FP) es una enfermedad pulmonar crónica común caracterizada por inflamación y daño al tejido pulmonar, así como por la formación de tejido cicatricial (fibrosis), lo que resulta en una función pulmonar deteriorada y, en última instancia, hace que los pacientes sientan falta de aliento y experimenten dificultad para respirar. (1). Entre los numerosos tipos diferentes de FP, la más común es la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), que afecta gravemente la calidad de vida de los pacientes.2). A pesar de una extensa investigación previa sobre el posible tratamiento de la PF, hasta la fecha no se conoce ninguna vía de curación completa para la PF. Debido a la comprensión limitada de la patogénesis de esta enfermedad, los síntomas de la PF generalmente se alivian y la progresión de la enfermedad se frena mediante medicamentos limitados, terapias de apoyo y trasplantes de pulmón.3, 4).
Amplias investigaciones previas indican que un proceso biológico importante en PF es la EMT (5, 6). Al inducir una pérdida de propiedades epiteliales típicas en las células epiteliales alveolares, la EMT hace que estas células adquieran rasgos de células mesenquimales y se transformen en células similares a fibroblastos.6). Como resultado, las células epiteliales se vuelven más invasivas y propensas a la migración y proliferación, lo que contribuye a la aparición y progresión de la fibrosis.6, 7). Además, la transformación celular inducida por la EMT puede hacer que las células liberen más componentes de la matriz extracelular (MEC), lo que en última instancia conduce al engrosamiento de la pared alveolar que exacerba directamente el grado de fibrosis pulmonar.5, 8). En los últimos años, la investigación sobre la EMT se ha convertido en un punto importante en los estudios de PF, muchos de los cuales indicaron que una inhibición dirigida de la EMT puede ser un medio eficaz para tratar la PF.9, 10).
El TGF-β desempeña un papel crucial en la regulación de la EMT; por lo tanto, bloquear la vía de señalización del TGF-β es un método muy eficaz para prevenir la EMT. Actualmente, se están probando en ensayos clínicos una variedad de fármacos dirigidos a la vía de señalización del TGF-β, incluidos anticuerpos e inhibidores de moléculas pequeñas.4, 11). Sin embargo, otros investigadores sugirieron que, en vista de la complejidad de la vía y su enorme impacto en las células, apuntar directamente a la vía de señalización del TGF-β para inhibir la fibrosis es riesgoso (12). En cambio, como argumenta (13), se deben buscar objetivos terapéuticos alternativos eficaces a través de una comprensión más profunda de la vía de la fibrosis regulada por TGF-β.
Además, actualmente se sabe que los efectos profibróticos del TGF-β están regulados positiva y negativamente por interacciones con otras vías de señalización, así como por ARN no codificantes.14). En los últimos años, la atención de la investigación se centró especialmente en el papel del microARN (miARN) en la aparición y desarrollo de la PF (15, 16). Los miARN, una clase de moléculas cortas de ARN no codificantes que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión genética (17, 18), están estrechamente relacionados con el mecanismo de la PF.
Las formas específicas en las que los miARN se relacionan con la PF son las siguientes. En primer lugar, los miARN pueden regular directamente la expresión de genes relacionados con la fibrosis y, por tanto, afectar el proceso de PF. Por ejemplo, la regulación dirigida de TGFBR3 por miR-23b-3p y miR-27b-3p puede lograr la regulación de los fibroblastos auriculares (19, 20). En segundo lugar, los miARN pueden regular el proceso de fibrosis controlando la proliferación, la apoptosis y la transformación epitelial-mesenquimatosa de células clave. Por ejemplo, miR-29c (21) y miR-184 (22) se informó previamente que bloquean la PF al regular la renovación y la apoptosis de las células epiteliales. En varios estudios previos relacionados con cicatrices de la piel, se encontró que algunos miARN (miR-519d y miR-9-5p) regulan la proliferación de fibroblastos (23, 24). En la fibrosis hepática, la investigación existente se centró principalmente en la activación y regulación de la proliferación de miARN en las células estrelladas hepáticas (25,26,27). Además, evidencia reciente sugiere que los ARN no codificantes largos en tándem generalmente interactúan con vías de señalización relacionadas mediante la regulación de miARN, afectando así indirectamente el proceso de fibrosis.28). Otra forma importante en la que los miARN regulan el proceso de fibrosis es mediante el control de la inflamación y la regulación inmune (29, 30). Finalmente, también se informó que los miARN regulan la fibrosis al participar en la síntesis y degradación de la ECM, que está estrechamente relacionada con la activación de los fibroblastos y la diferenciación de los miofibroblastos.28, 31,32,33). Curiosamente, al administrar miR-142-3p a los fibroblastos pulmonares y las células epiteliales alveolares, se descubrió que los exosomas generados a partir de macrófagos retardan el avance de la fibrosis pulmonar (34).
Entre los miARN asociados con la PF y la patogénesis del cáncer, se considera consensualmente que el miR-125b es el miARN «estrella» (35). MiR-125b es un componente esencial de la señalización profibrótica en el corazón (36). Además, se descubrió que la activación de la señalización de RhoA por miR-125b promueve la activación de las células estrelladas hepáticas y la fibrosis hepática (37). Sin embargo, el papel de miR-125b en el proceso de PF sigue siendo incierto.
En este estudio, se identificó que miR-125b-5p tenía baja expresión en pulmones fibróticos de ratón mediante secuenciación de miARN combinada con RT-qPCR. Para dilucidar el papel de miR-125b-5p en la fibrosis pulmonar, observamos el impacto de miR-125b-5p en la fibrosis y los procesos de transición epitelial-mesenquimal (EMT) utilizando un modelo de fibrosis pulmonar de ratón y una línea celular epitelial de pulmón/bronquial. Posteriormente, realizamos experimentos celulares para explorar el mecanismo regulador de miR-125b-5p. Los resultados nos permitieron determinar que miR-125b-5p inhibe el proceso EMT en las células epiteliales del pulmón al apuntar a BAK1, inhibiendo así la activación de los miofibroblastos pulmonares, lo que, a su vez, contribuye a atenuar la fibrosis pulmonar.
Materiales y métodos
Modelado animal y recogida de muestras.
Se obtuvieron ratones C57BL/6 (8 semanas, 18∼20 g, macho) de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, China) y se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (15 para control, 11 para BLM, 11 para Agomir- NC y 11 para Agomir). A los animales del grupo BLM se les administró por vía intratraqueal una dosis de 1 mg/kg de bleomicina (BLM) (MedChemExpress LLC, China) disuelta en 50 µl de solución salina estéril. El grupo de control recibió 50 µl de solución salina estéril por vía intratraqueal de la misma manera. Los animales del grupo Agomir recibieron una inyección en la vena de la cola de Agomir-125b-5p o Agomir-NC (Shanghai GenePharma Co., Ltd) a una dosis de 4 mg/kg disueltos en 100 µl de solución salina estéril el día 7 del tratamiento con BLM. Los ratones fueron sacrificados el día 14 después de la administración de BLM, después de la monitorización del oxígeno en sangre y las pruebas de función pulmonar (38). Se recogieron tejidos pulmonares para su fijación, inclusión y seccionamiento. Posteriormente se realizaron H&E, tinción de Masson y ensayos inmunohistoquímicos. También se requirieron tejidos pulmonares frescos para la extracción de proteínas y los ensayos de transferencia Western (WB). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Fujian (2019 – 103).
Histología pulmonar, tinción tricromática, inmunohistoquímica (IHC) y amplificación de señal de tiramina (TSA)
El tejido pulmonar del ratón se empapó en una solución de formalina tamponada neutra al 10% durante la noche, se deshidrató según procedimientos estándar, se desengrasó en xileno embebido en parafina y se cortó en rodajas de 5 μm de espesor. Luego, las rodajas se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). El área fraccionada de alteraciones patológicas en el parénquima pulmonar se calculó utilizando el software Image J (v1.8.0). Para observar el grado de fibrosis pulmonar, las rodajas se tiñeron con el kit de tinción tricrómica de Masson (n.º de catálogo 77148, Guangzhou Wexis Biotech Ltd.) y se analizó la fracción de volumen (%) de las fibras de colágeno con los marcadores Image J. Fibrosis (FN1). y α-SMA) y la expresión de BAK1 (12105 S, CST) se evaluaron utilizando IHC (39). Después de la desparafinación, las rodajas se incubaron en un tampón de ácido cítrico de 0,01 mol/l, pH 6,0, en un horno de microondas durante 15 minutos para la reparación del antígeno. Luego, las rodajas se enfriaron y se incubaron en H2O2 al 3% durante 10 minutos para inactivar la peroxidasa endógena, luego se bloquearon con suero de cabra no inmune a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se añadió el anticuerpo primario durante la noche a 4 ℃. Posteriormente, al agregar el reactivo MaxVisionTM (KIT-5005 MaxVisionTM HRP-Polymer anti-rabbit IHC Kit), las rodajas de tejido se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Finalmente, se añadió la solución reveladora de color DAB recién preparada. Después de 5 minutos, las células teñidas se montaron y se observaron con un microscopio óptico.
Para experimentos de TSA en secciones de parafina de pulmones de ratón, el kit (G1236, Servicebio® TSAPLus,…
