Los moduladores del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística atenúan la activación y agregación de plaquetas en la sangre de donantes sanos y pacientes con COVID-19

Al editor:

Un trabajo reciente identificó el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística del canal de cloro (CFTR), cuyas mutaciones pueden causar fibrosis quística (FQ), como un importante regulador de la función plaquetaria, ya que su pérdida o inhibición provoca la hiperactivación plaquetaria inducida por agonistas. [1]. Por lo tanto, la activación de CFTR puede presentar una estrategia novedosa para contrarrestar la hipercoagulabilidad plaquetaria. Últimamente, se han aprobado clínicamente varios grupos de moduladores de CFTR para aumentar la abundancia y/o la probabilidad de apertura del canal de CFTR en la membrana celular en pacientes con FQ. Si bien originalmente estaba dirigido a mutaciones específicas de CFTR, la evidencia emergente sugiere que los moduladores de CFTR también pueden aumentar la actividad del canal de CFTR de tipo salvaje (CFTR_peso). Específicamente, se demostró que el modulador CFTR ivacaftor 1) aumenta el CFTR_pesocorriente de cortocircuito mediada por epitelios [2]2) aumentar CFTR_pesoCl transmembrana mediado por⁻ flujo en las células endoteliales [3]y 3) inducir la relajación de la arteria pulmonar dependiente de la dosis en ratas de tipo salvaje [4]. Aumentos análogos en CFTR_peso se informó actividad para los moduladores CFTR C18 y lumacaftor [5]. Por lo tanto, postulamos que ivacaftor puede ejercer efectos anticoagulantes sobre las plaquetas independientemente de las mutaciones de CFTR, y evaluamos sus efectos sobre la activación, adhesión y agregación de plaquetas de donantes sanos (HD).

La estimulación con los agonistas plaquetarios adenosina difosfato (ADP) o la proteína 6 activadora del receptor de trombina (TRAP6) mejoró la expresión superficial de los marcadores de activación CD62p y CD63 en las plaquetas con EH. Esta regulación al alza fue atenuada por el pretratamiento con ivacaftor (figura 1a). La forskolina, un activador de CFTR efectivo pero clínicamente no aplicable, se usó como control positivo en función de su capacidad para inducir CFTR_peso conductancia a través de fosforilación de su dominio regulador (R) [6]. A continuación, evaluamos el efecto de ivacaftor sobre los aumentos inducidos por agonistas en Ca intracelular²⁺ concentración ([Ca²⁺]_i) como “segundo mensajero” clave de la activación plaquetaria. Como se mostró anteriormente, la disfunción de CFTR en las plaquetas da como resultado una hiperactivación inducida por agonistas y un aumento de Ca²⁺ entrada [1]. La activación con ADP o TRAP6 indujo una robusta [Ca²⁺]_i respuesta, que fue atenuada por el pretratamiento con ivacaftor, replicando cualitativamente los efectos de la forskoline (figura 1b y C). De manera análoga, el pretratamiento con ivacaftor redujo la agregación de plaquetas de HD inducida por agonistas ex-vivo (figura 1d) y disminución de la adhesión plaquetaria en sangre total de HD no estimulada y estimulada con agonistas plaquetarios en un in vitro modelo que imita la interacción plaquetas-matriz extracelular (figura 1e).

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FIGURA 1

El tratamiento previo con ivacaftor reduce la activación, la adhesión y la agregación plaquetarias. Las plaquetas de donantes sanos (HD) se pretrataron con vehículo, ivacaftor 10 µM o forskolina 5 µM antes de la estimulación con TRAP6 5 µM o ADP 10 µM, o sin (sin) estimulación. a) Expresión superficial de CD62p y CD63 en CD42b⁺ plaquetas b) Inducida por agonistas [Ca²⁺]_i transitorios trazados como relación de fluorescencia de Ca²⁺-unido (405 nm) a Ca²⁺-no unido (530 nm) indo-1 AM en CD42b⁺ plaquetas c) Cuantificación de [Ca²⁺]_i transitorios en (b) como área bajo la curva (AUC). d) Agregación de plaquetas inducida por agonistas evaluada mediante agregometría de impedancia (Roche, Alemania) en muestras de sangre con hirudina. e) Para la adhesión de plaquetas, se tiñó sangre HD con citrato con anticuerpo anti-CD42b y se perfundió a través de cámaras de flujo de microcanales recubiertas de colágeno IV (Ibidi, Alemania). CD42b totales⁺ El área cubierta se cuantificó en cinco regiones de interés seleccionadas al azar para cada condición experimental (ImageJ, versión 13.0.6). f) Resumen de pacientes con COVID-19 y cohortes de HD, ambos sin fibrosis quística (FQ), muestreados en Charité – Universitätsmedizin Berlin, Alemania (estudio de cohorte Pa-COVID-19 [15] aprobaciones de ética EA2/066/20 y EA2/075/15), y los Centros Médicos de la Universidad de Ámsterdam, Países Bajos (aprobación de ética METc-número 2021.0520) de acuerdo con la escala de progresión clínica de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para COVID-19. La inclusión de pacientes requería una prueba de PCR positiva para SARS-CoV-2 y> 18 años de edad. Se excluyeron los pacientes tratados con antiagregantes plaquetarios. g) Expresión superficial de CD62p y CD63 en CD42b⁺ plaquetas de pacientes con COVID-19 con enfermedad moderada o grave en comparación con HD. h) Trazos representativos de inducido por agonista [Ca²⁺]_i transitorios en plaquetas de pacientes con COVID-19 grave (sin FQ). i) Cuantificación de [Ca²⁺]_i transitorios medidos en (h) como AUC. j) Agregación de plaquetas inducida por agonistas de pacientes con COVID-19 grave (sin FQ). k) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de CD42b⁺ plaquetas de pacientes con COVID-19 grave (sin FQ) adheridas a colágeno-IV tras perfusión con sangre total recalcificada pretratada con vehículo, ivacaftor o forskolina, y estimulada con vehículo o ADP. Barra de escala: 100 μm‌. l) Cuantificación de la adhesión de plaquetas evaluada en (k) como en (e). Representación gráfica: cada círculo (a, c, d, e, g, i, j, l) representa las plaquetas de un HD/paciente individual; las líneas representan comparaciones intraindividuales; las barras indican la media. *: p≤0.05; **: p≤0.005; ***: p≤0,001 por ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Holm-Šídák (a, c, d, e, g, i, j, l). Los datos son representativos de a) n=12, c) n=8, d) n=7–19, e) n=4–8, g) n=20 (todos los HD), n=30 para moderado y n =22 para casos graves, i) n=8 cada uno para casos graves, j) n=6–15 para casos graves y l) n=6–12 para casos graves de COVID-19 después de la activación plaquetaria inducida por ADP o TRAP6 después del pretratamiento con vehículo, ivacaftor o forskoline. ECMO: oxigenación por membrana extracorpórea; VNI: ventilación no invasiva.

Para trasladar el efecto anticoagulante emergente de los moduladores de CFTR a la práctica clínica, investigamos la asociación de la terapia con moduladores de CFTR con eventos tromboembólicos en pacientes con FQ, el único grupo de pacientes para los que están aprobados los moduladores de CFTR. Analizamos retrospectivamente los datos clínicos de 4012 pacientes con FQ que recibieron terapia única o combinada con ivacaftor, lumacaftor, tezacaftor o elexacaftor, y los comparamos con 4012 pacientes con FQ no tratados de la misma edad, sexo y medicación de la base de datos del mundo real de TriNetX, LLC [7]. Se realizó una coincidencia de puntuación de propensión para el uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos, anticoagulantes, inhibidores de la agregación y activación plaquetaria, catecolaminas y otros vasopresores y corticosteroides antes del análisis de resultados. La terapia con moduladores CFTR redujo el riesgo de muerte y ventilación mecánica en un 34,1 % (OR 0,483, IC 95 % 0,385–0,606) y 40,1 % (OR 0,266, IC 95 % 0,137–0,519), respectivamente. Este efecto terapéutico se asoció estrechamente con menos manifestaciones tromboembólicas, como lo indica una reducción sustancial del riesgo de infarto de miocardio (IM) (−60,0 %; OR 0,371, 95 % IC 0,230–0,597), accidente cerebrovascular (−55,8 %; OR 0,428, 95 % IC 0,326–0,563), trombosis arterial (−54,6 %; OR 0,454, 95 % IC 0,270–0,762) y embolia pulmonar (−38,1 %; OR 0,609, 95 % IC 0,429–0,866), mientras que la reducción del riesgo de vena profunda trombosis (OR 0,784, IC 95% 0,607-1,012) no alcanzó significación. Para evaluar si este efecto preventivo de los moduladores de CFTR persiste en un escenario que predispone a complicaciones tromboembólicas, analizamos retrospectivamente un total de 4050 pacientes con FQ con COVID-19 agudo, la mitad de los cuales recibieron moduladores de CFTR, para obtener los mismos resultados. De manera análoga a los resultados en pacientes sin COVID-19, no se evidenció una diferencia significativa en los recuentos de plaquetas (2,7 ± 1,0 × 10⁵ células·µL⁻¹ (sin tratar), 2,8±1,0×10⁵ células·µL⁻¹ (modulador CFTR)) o en la capacidad de coagulación de la sangre (tiempo de protrombina: 13,5±10,5 (sin tratar), 13,4±9,8 s (modulador CFTR); relación internacional normalizada: 1,5±4,2 (no tratado), 1,3±2,0 (modulador CFTR) ) en función de la terapia moduladora de CFTR. Sin embargo, los riesgos de muerte (−45,5 %; OR 0,529, IC 95 % 0,351–0,797) o ventilación mecánica (−53,9 %; OR 0,474, IC 95 % 0,293–0,767) volvieron a reducirse significativamente con los moduladores de CFTR, al igual que los riesgos de IM (−50,0 %; OR 0,520, IC 95 % 0,306–0,885), ictus (−76,7 %; OR 0,222, IC 95 % 0,136–0,363), trombosis arterial (−54,6 %; OR 0,432, IC 95 % 0,205–0,910) ), y coagulopatías asociadas a COVID-19 características, a saber, trombosis venosa profunda (−61,1 %; OR 0,394, IC 95 % 0,255–0,609) y embolia pulmonar (−60,1 %; OR 0,386, IC 95 % 0,252–0,591).

Con base en estos datos epidemiológicos que indican un efecto terapéutico de los moduladores de CFTR en las complicaciones hipercoagulopáticas y tromboembólicas en COVID-19, replicamos nuestros análisis de los efectos de ivacaftor en la hiperactivación, adhesión y coagulación plaquetarias en la sangre de pacientes con COVID-19 agudo (figura 1f). Similar a los resultados mostrados en figura 1a–e, ninguno de estos pacientes tenía FQ. En relación con las HD, las plaquetas de pacientes con COVID-19 agudo mostraron una expresión superficial mejorada de CD62p y CD63 en función de la gravedad de la enfermedad (figura 1g), destacando el estado de hipercoagulabilidad en la COVID-19. Similar a nuestros hallazgos en HD, ivacaftor atenuado inducida por agonista [Ca²⁺]_i respuestas en plaquetas de pacientes graves con COVID-19 (figura 1h y yo). Si bien el pretratamiento con ivacaftor fue solo moderadamente efectivo en la reducción de la agregación plaquetaria inducida por TRAP6 en HD (−12,2 %), la efectividad fue alta en pacientes con COVID-19 grave (−49,2 %), fenocopiando cualitativamente el efecto de la forskolina (figura 1j). De acuerdo con este efecto anticoagulante, ivacaftor redujo la adhesión de plaquetas estimuladas y no estimuladas en la sangre completa de pacientes graves con COVID-19 (figura 1k y yo).

La modulación de CFTR atenúa la activación, la adhesión y la agregación de plaquetas en la sangre de pacientes con HD y pacientes con COVID-19 agudo, y promete reducir las complicaciones tromboembólicas en la clínica. Queda por dilucidar hasta qué punto esta atenuación dependiente de CFTR está mediada por su función clásica como canal de cloruro o por su papel propuesto en la formación y composición de balsas lipídicas como centros de señalización. [8]. Como CFTR también se expresa en células endoteliales [9]neutrófilos y monocitos, los beneficios anticoagulantes de la terapia moduladora CFTR en vivo puede atribuirse en parte a los efectos sobre las células no plaquetarias. A medida que los agregados de plaquetas y leucocitos circulantes se correlacionan con la gravedad de COVID-19 [10]queda por ver si los moduladores de CFTR también se dirigen, por ejemplo, a la activación de neutrófilos y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos asociada a agregados en pacientes con COVID-19 [11]. El tratamiento de pacientes con COVID-19 con aspirina, apixabán o inhibidores de P2Y12 no logró una reducción significativa de los eventos tromboembólicos en el ensayo multicéntrico RECOVERY [12] o el ensayo ACTIV4a [13]. Además, el tratamiento de plaquetas de pacientes graves con COVID-19 con aspirina no logró reducir la agregación plaquetaria ex-vivo [14]. Por el contrario, nuestros resultados demuestran un efecto anticoagulante de ivacaftor ex-vivo, especialmente en plaquetas de pacientes con COVID-19 grave, lo que sugiere una mayor promesa de esta estrategia para reducir el riesgo de eventos trombóticos en el manejo clínico de pacientes con COVID-19.

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