Resumen
Objetivos
En este estudio, investigamos si el gen tipo 4 (NEDD4L), expresado en células precursoras neurales y regulado negativamente durante el desarrollo, es la enzima E3 de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y si NEDD4L degrada ACE2 a través de la ubiquitinación, lo que lleva a la progresión de la enfermedad pulmonar. Hipertensión arterial (HAP).
Métodos
Se utilizaron análisis bioinformáticos para explorar la ligasa E3 que ubiquitina ACE2. Se utilizaron células cultivadas del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC) y muestras de pacientes con HAP para investigar la interferencia entre NEDD4L y ACE2 y su ubiquitinación en el contexto de la HAP.
Resultados
La inhibición de la ubiquitinación atenuó la proliferación de PASMC inducida por hipoxia. Los niveles de NEDD4L aumentaron y los de ACE2 disminuyeron en los tejidos pulmonares de pacientes con PAH y en PASMC. NEDD4L, la ligasa E3 de ACE2, inhibió la expresión de ACE2 en PASMC, posiblemente a través de degradación mediada por ubiquitinación. La HAP se asoció con una regulación positiva de la expresión de NEDD4L y una regulación negativa de la expresión de ACE2.
Conclusiones
NEDD4L, la enzima de ubiquitinación E3 de ACE2, promueve la proliferación de PASMC, lo que en última instancia conduce a la HAP.
Introducción
La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad mortal caracterizada por un aumento progresivo de la presión vascular pulmonar (1). La vasculatura pulmonar sufre lesiones oclusivas, vasoconstricción anormal y resistencia vascular pulmonar (PVR). La RVP obstructiva en la HAP aumenta la poscarga del ventrículo derecho, lo que provoca disfunción ventricular derecha y, en última instancia, la muerte.2). Las células vasculares de las arterias pulmonares incluyen células endoteliales internas, células del músculo liso de la media y fibroblastos adventiciales. Un fenotipo proliferativo y resistente a la apoptosis de las células del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC) produce engrosamiento medial y lesiones vasculares oclusivas.3, 4). La hipoxia, un estímulo fundamental en el microambiente pulmonar, desencadena una cascada de eventos celulares y moleculares que culminan en la hiperplasia de las PASMC.5). Esta respuesta proliferativa está orquestada por una compleja interacción de factores de crecimiento, citoquinas y vías de señalización, lo que en última instancia conduce a un desequilibrio en los mecanismos homeostáticos que gobiernan la arquitectura vascular.6). Esta proliferación sirve como piedra angular de la PVR, un sello patológico en la progresión de la HAP (7). Sin embargo, actualmente no existen tratamientos efectivos para detener su desarrollo (8). Según nuestro estudio anterior, la disminución de la expresión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) promueve la expresión de la quinasa de adhesión focal, lo que a su vez conduce a una mayor proliferación de PASMC, lo que resulta en PVR y, en última instancia, PAH (9).
Identificado en 2000 (10), ACE2, que comparte aproximadamente un 61 % de homología de secuencia con los dominios catalíticos de su homólogo ACE1, hidroliza principalmente Ang II en Ang-(1–9) y Ang-(1–7) con alta eficiencia (11). Tanto la Ang-(1-9) como la Ang-(1-7) promueven la vasodilatación y disminuyen el crecimiento celular y las respuestas inflamatorias (12, 13). Dado que se ha informado sobre la regulación positiva de la expresión y señalización de Ang II en PASMC de vasos remodelados en los pulmones de pacientes con HAP idiopática, se ha demostrado que la infusión de ACE2 humana recombinante (NCT01884051) ofrece posibles beneficios hemodinámicos para el tratamiento de la HAP (11, 14). Sin embargo, los mecanismos por los cuales disminuye la expresión de ACE2 aún no están claros (15).
La ubiquitinación es clave para la regulación dinámica de la muerte celular programada. La desregulación de este proceso mediante la regulación de enzimas y objetivos de procesos celulares fundamentales involucrados en la muerte celular y la inflamación puede tener consecuencias patológicas.16, 17). El sistema ubiquitina-proteasoma regula la degradación de proteínas y el desarrollo de HAP, pero el conocimiento sobre cómo la ubiquitina ligasa E3 afecta la expresión de ACE2 es limitado.18). La degradación ubiquitinada de ACE2 es uno de los mecanismos de neumonía en estudios de infección por SARS-CoV-2 (19, 20). Se han llegado a conclusiones similares en estudios sobre hipertensión (21, 22). Un aumento de la presión intravascular pulmonar se asocia con inflamación pulmonar en pacientes con HAP (23, 24). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la disminución de ACE2 está asociada con su degradación mediante ubiquitinación en la HAP.
El gen tipo 4 (NEDD4L, también conocido como NEDD4-2), expresado en células precursoras neuronales, es la ligasa E3 dominante de la familia NEDD4, y la señalización relacionada desempeña un papel fundamental en las enfermedades cardiovasculares.25). MG-132, un inhibidor de la proteasa, puede inhibir las proteasas en el sistema de ubiquitinación, permitiendo que sobrevivan las proteínas que deberían ser degradadas por la ubiquitinación.26). En un modelo de HAP, la expresión de NEDD4L aumentó, mientras que estos cambios se suprimieron mediante el tratamiento de ratas con HAP con MG-132 (27). Sin embargo, no está claro si NEDD4L, una posible ligasa E3 de ACE2, exacerba la HAP al degradar ACE2.
Materiales y métodos
Aislamiento y cultivo de PASMC.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Xuzhou (número de aprobación: 2022105068). Se obtuvieron ratones machos C57BL/6 de tipo salvaje de 6 a 8 semanas de edad de Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. El número de licencia del animal es SCXK (Beijing) 2021-0011. Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico antes de la eutanasia por hemorragia ventricular derecha. Las PASMC se obtuvieron utilizando un método mejorado de inoculación de trozos de tejido mediante digestión con tripsina (28). Se observó la morfología celular bajo un microscopio de contraste de fase invertido y se generó una curva de crecimiento celular contando las células. Se utilizó la tinción de inmunofluorescencia (IF) para α-actina del músculo liso (α-SMA) para evaluar el tipo de célula y la pureza de las PASMC (que se muestran en verde, figura complementaria. 1). Las PASMC se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 15 % de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina, y se colocaron en una incubadora a 37 °C, humedad saturada y 5 % de CO2. Las PASMC se sometieron a un tratamiento hipóxico en una cámara hipóxica (MIC-101, Billups-Roche, EE. UU.) con una concentración de O2 del 4% durante 24 h.
Los reactivos utilizados y sus fuentes comerciales fueron los siguientes: cicloheximida (CHX; 239763, Sigma‒Aldrich, Alemania); MG132 (M7449, Sigma‒Aldrich, Alemania); DMEM (iCell-0001, iCell Bioscience, China); anti-α-SMA (ab7817, Abcam, Reino Unido); anti-ACE2 (21115-1-AP, Proteintech, EE. UU.); anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 60004-1-Ig, Proteintech, EE. UU.); anti-NEDD4L (ab46521, Abcam, Reino Unido); anti-caspasa-3 y anti-ratón doble minuto 2 (MDM2; ab259265, Abcam, Reino Unido); Kit de recuento de células-8 (CCK-8; HY-K0301, MedChemExpress, EE. UU.); inmunoglobulina (Ig)G (H + L) anti-ratón de cabra conjugada con coraLite488 (SA00013-1, Proteintech, EE. UU.); y un kit de tinción EdU (KGA331, Keygen Biotech, China).
Muestras de pulmón humano
Este estudio también fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Xuzhou (número de aprobación: XYFY2022-KL401-01) y registrado en el centro de ensayos clínicos (número de registro: ChiCTR2200066496). Estas muestras se obtuvieron del Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Xuzhou y del Hospital Popular de Wuxi. Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. Los autores afirman que los participantes humanos dieron su consentimiento informado para la publicación de las imágenes de la Fig. 1A. Después de que los sujetos dieron su consentimiento informado y aceptaron someterse a una biopsia de pulmón, se realizó una biopsia de pulmón para obtener muestras de tejido pulmonar de seis pacientes con HAP que se sometieron a un trasplante de pulmón y de seis pacientes que se sometieron a una neumonectomía por nódulos benignos sin HAP. Con base en consideraciones éticas, seleccionamos pacientes con HAP que se sometieron a trasplante de pulmón con un diagnóstico primario de HAP hipóxica para el grupo de HAP y pacientes que se sometieron a resección de nódulos pulmonares con un diagnóstico primario de nódulos pulmonares benignos para el grupo de control.
Figura 1Los niveles de expresión de proteínas de NEDD4L y ACE2 se correlacionan negativamente en condiciones de hipoxia. Recolectamos muestras de tejido pulmonar de pacientes diagnosticados con HAP causada por hipoxia. Estas muestras se sometieron a tinción HE para evaluación histológica y análisis de transferencia Western para cuantificar los niveles de expresión de proteínas. Imágenes histológicas teñidas con HE de arterias pulmonares (A), con la flecha blanca indicando la arteria pulmonar (diámetro ≤ 200 μm). Muscularización (B) y las proporciones del espesor de la fracción del medio (do) se determinaron seleccionando 20 a 40 arteriolas pulmonares con un diámetro de ~ 50 μm. Los niveles de expresión de proteínas de NEDD4L (D, mi) y ACE2 (D, F) se detectaron mediante transferencia Western y se utilizó GAPDH como referencia interna. La correlación entre la expresión en las muestras (GRAMO) y que en la base de datos GEO (h) fue analizado (GSE22356; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE22356). El conjunto de datos de secuenciación de ARN GEO (GSE22356) se generó a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con y sin hipertensión pulmonar asociada a esclerodermia. N = 4, **P < 0,01, ***P < 0,001. NEDD4L, tipo 4, expresado en células precursoras neurales, regulado negativamente durante el desarrollo; ACE2, enzima convertidora de angiotensina 2; HAP: hipertensión arterial pulmonar; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; GEO, Ómnibus de expresión genética
Imagen a tamaño completoTransfección celular
Primero, se transfectó NEDD4L-siRNA 20 nM o ARN de control codificado, diseñado y sintetizado por GUANGZHOU IGE Biotechnology Ltd. (China), en PASMC a una concentración (cada 1,5 µl de reactivo Lipofectamine RNAi Max con 25 µL de OPTI-MEM) de Lipofectamine RNAi. Max (13778150, Invitrogen, EE. UU.). NEDD4L-pEGFP-N1 y ACE2-pEGFP-N1 fueron diseñados por SnapGene (https://www.snapgene.com/) y construido por Biohealth. NEDD4L-pEGFP-N1, ACE2-pEGFP-N1 y el vector se transfectaron en PASMC usando Lipofectamine 3000 (L3000001, Invitrogen) diluida con OPTI-MEM (11058021, Gibco, EE. UU.).
método in silico
Navegador Ubi (
