Resumen
Antecedentes
El factor regulador de interferón 1 (IRF1) es un factor de transcripción que desempeña un papel importante en diversos procesos biológicos, incluidas las lesiones inflamatorias, las infecciones virales, la muerte celular y las respuestas inmunitarias, y se ha estudiado ampliamente en el contexto de diferentes enfermedades pulmonares. Sin embargo, el mecanismo subyacente a su implicación en la fibrosis pulmonar sigue siendo en gran medida desconocido.
Métodos
Se sometieron ratones de tipo salvaje (WT), ratones IRF1 global-null (Irf1-/-) a un modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina para permitir el examen del papel de IRF1 en la fibrosis pulmonar. Se realizó un análisis proteómico del tejido pulmonar de ratones WT e Irf1-/- tratados con solución salina o bleomicina para explorar el mecanismo de IRF1 en la regulación de la fibrosis pulmonar.
Resultados
En el modelo de ratón con fibrosis inducida por bleomicina, se observó una mayor expresión de IRF1. Los ratones knockout para Irf1 mostraron una disminución de la fibrosis pulmonar en relación con los ratones WT después del tratamiento con bleomicina. La expresión proteica de fibronectina, evaluada mediante el análisis de transferencia Western de tejidos pulmonares, se reguló negativamente en ratones Irf1-/-. Observamos una reducción similar en el contenido de colágeno mediante la detección de hidroxiprolina. Histológicamente, hubo menos depósito de colágeno en los pulmones de los ratones Irf1-/- en comparación con los ratones WT. Los datos proteómicos revelaron que IRF1 puede estar involucrado en la fibrosis pulmonar mediante la regulación de la ferroptosis. Determinamos que la paraoxonasa 1 (PON1), una proteína mal caracterizada en la fibrosis pulmonar, estaba regulada positivamente en ratones Irf1-/- después de la exposición a bleomicina. Los experimentos in vitro revelaron que IRF1 podría regular el nivel de GSH y MDA a través de PON1. También determinamos que los niveles de PON1 eran más bajos en el plasma de pacientes con FPI en comparación con los controles sanos.
Conclusión
Nuestros datos resaltan la importancia de IRF1 en el proceso fibrótico, y PON1 puede ser un mediador potencial de IRF1 en la progresión de la fibrosis pulmonar.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar progresiva y devastadora de etiología desconocida. A pesar del creciente interés en la FPI, aún se desconocen los mecanismos moleculares precisos que subyacen al desarrollo de la fibrosis y que conducen a la destrucción irreversible del pulmón, y faltan terapias efectivas para la fibrosis pulmonar.1).
Los factores reguladores de interferón (IRF) constituyen una familia de factores transcripcionales que comprende nueve miembros (IRF1-9) en células de mamíferos, que originalmente se identificaron como reguladores transcripcionales de interferones tipo I. IRF-1 se expresa en varios tejidos y células (2, 3) y se ha informado que está involucrado en lesiones inflamatorias, infecciones virales, regulación del crecimiento celular, muerte celular y respuestas inmunes (3,4,5,6). Se sabe que las anomalías inmunitarias, la inflamación y la muerte celular son los mecanismos patogénicos clave detrás de muchas enfermedades pulmonares. En nuestro estudio anterior, encontramos que IRF1 estaba involucrado en la lesión pulmonar aguda a través del estrés oxidativo, la inflamación y la muerte celular programada (7,8,9,10). Aunque IRF1 se ha estudiado mucho, su papel en la fibrosis no se ha dilucidado por completo. Estudios recientes han encontrado que IRF1 está involucrado en la fibrosis de órganos importantes como el corazón, el riñón y el hígado; IRF1 contribuye al proceso de fibrosis renal a través de la regulación negativa de Klotho (11). Se ha demostrado que la sobreexpresión cardíaca específica de IRF1 exacerba condiciones como la hipertrofia cardíaca inducida por la banda aórtica, la dilatación ventricular y la fibrosis, mientras que se ha descubierto que los ratones deficientes en IRF1 (knockout) exhiben una respuesta hipertrófica significativamente reducida.12). Hasta la fecha, no se ha estudiado el papel de IRF1 en la fibrosis pulmonar. Además, el mecanismo por el que IRF1 regula la fibrosis pulmonar sigue siendo en gran medida desconocido.
En el estudio actual, demostramos un papel clave desempeñado por IRF1 en la patogénesis de la fibrosis pulmonar utilizando ratones knockout para IRF1. El perfil proteómico en este estudio revela un posible vínculo novedoso entre IRF1 y la ferroptosis mediante la regulación de la paraoxonasa 1 (PON1) en la progresión de la fibrosis pulmonar.
Métodos
Ratones
Se adquirieron ratones WT C57BL/6 de Silaike Laboratory Animal Co Ltd (Changsha, China). Se obtuvieron ratones knockout para Irf1 (Irf1-/-) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME, EE. UU.) y se mantuvieron en el centro de animales de laboratorio de la Universidad Central Sur en condiciones específicas libres de patógenos. En los experimentos se utilizaron ratones de siete a ocho semanas de edad, emparejados por edad y sexo. Todos los experimentos y procedimientos con animales en este estudio siguieron protocolos aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad Central Sur.
Modelo de fibrosis pulmonar con bleomicina
Se trataron ratones del mismo sexo y peso con una única inyección intratraqueal de bleomicina (2,5 mg/ratones, Selleck, S1214) para inducir fibrosis pulmonar. Los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100/10/mg/kg) y se intubaron con un microaspersor (compañía Yuyan, Shanghai, China) con la ayuda de laringoscopia directa. La bleomicina se diluyó en 50 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administró mediante instilación intratraqueal con un micropulverizador para promover una distribución generalizada en los pulmones.13, 14). Los ratones de control recibieron una instilación intratraqueal de 50 µl de PBS únicamente. Los ratones fueron sacrificados 7, 14 o 21 días después de la administración de bleomicina (BLM).
Análisis proteómico cuantitativo TMT.
Se recogieron tejidos pulmonares de ratones WT o Irf1-/- sometidos a instilación de PBS o bleomicina y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los análisis proteómicos fueron procesados por Ouyi Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Las proteínas con cambios de cuantificación> 1,5 y un valor de p <0,05 se definieron como proteínas expresadas diferencialmente. Después de identificar las proteínas expresadas diferencialmente, se realizó un análisis de enriquecimiento de Gene Ontology/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (GO/KEGG) para describir las funciones de estas proteínas. Brevemente, los pasos fundamentales del proceso de proteómica cuantitativa de etiquetado TMT se describen a continuación: Inicialmente, las proteínas totales se extraen de las muestras. Se reserva una porción para la medición de la concentración de proteínas y el análisis SDS-PAGE. Otra alícuota se somete a digestión enzimática mediada por tripsina y posterior marcaje. Luego se combinan volúmenes iguales de cada muestra marcada para la separación cromatográfica. El paso final implica el análisis LC-MS/MS y la interpretación completa de los datos de la muestra agrupada. Nuestro enfoque bioinformático comienza con la recuperación y cuantificación de datos proteómicos, avanzando a través de la evaluación de la calidad y el preprocesamiento de datos. A esto le sigue un análisis de los niveles de expresión de proteínas y un perfil funcional de las proteínas identificadas utilizando múltiples bases de datos. Las proteínas expresadas diferencialmente se analizan más a fondo mediante análisis de ontología genética (GO), análisis de vías y mapeo de interacción proteína-proteína. Los datos comparativos entre grupos se evalúan mediante análisis de correlación, agrupación de patrones de expresión en mapas de calor y análisis de diagramas de Venn para identificar características únicas y compartidas. Además, según el conjunto de datos, profundizamos en la relevancia y el significado de nuestros hallazgos, identificando proteínas clave y sus funciones o vías asociadas para una investigación y validación más profundas.
Ensayo de hidroxiprolina (HYP)
Se recogieron pulmones murinos el día 21 después de la instilación de bleomicina o PBS. Se obtuvieron los pulmones izquierdos para la cuantificación de hidroxiprolina ácida, que se realizó utilizando un kit de ensayo de hidroxiprolina (catálogo A030-3–1, Nanjing Jiancheng, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este método se basa en el principio de que los subproductos de oxidación de la hidroxiprolina y el agente oxidante interactúan con el dimetilaminobenzaldehído, lo que da como resultado la formación de un cromóforo de color rojo púrpura. La intensidad de esta coloración es directamente proporcional a la concentración de Hyp presente en la muestra. La posterior medición de colágeno se ejecutó siguiendo el protocolo establecido por Crouse et al. en 1986. Se determinó que la hidroxiprolina constituye el 13,4% del contenido de colágeno, que luego se utilizó para convertir los valores medidos para reflejar el contenido total de colágeno en las muestras. Los pasos básicos se muestran a continuación: homogeneizar e hidrolizar muestras, luego neutralizar y centrifugar para recolectar el sobrenadante. Centrifugar para recoger el sobrenadante y preparar estándares de hidroxiprolina para la curva de calibración. Agregue agente oxidante y luego revelador para formar un cromóforo. Después de la incubación, leer a 550 nm. Utilice la curva estándar para determinar los niveles de hidroxiprolina, ajustando por dilución.
Ensayos de glutatión (GSH) y disulfuro de glutatión (GSSG)
Se utilizaron tejidos pulmonares frescos para la detección de GSH y GSSG, que se realizó con un kit adquirido en Beyotime (S0053) siguiendo el protocolo del fabricante. En esencia, el GSSG, una vez formado, puede volver a convertirse eficientemente en GSH mediante la glutatión reductasa en presencia de NADPH. El ensayo se compone de dos partes: la preparación de extractos de tejido y la detección de glutatión total (GSH y GSSG). El GSH se puede desactivar en la muestra simplemente agregando el reactivo de enmascaramiento. Por lo tanto, el GSSG solo por temperatura se detecta midiendo la absorción (λmax = 412 nm) de DTNB (5,5 edithiobis (ácido 2-nitrobenzoico). Además, la cantidad de GSH se puede determinar restando GSSG de la cantidad total de glutatión. .
Ensayo de malondialdehído (MDA)
Se utilizaron tejidos pulmonares frescos para los ensayos de MDA, que se realizaron utilizando un kit adquirido en Beyotime (S0131) y se siguió el protocolo del fabricante. El ensayo implica la reacción de productos de peroxidación lipídica, principalmente MDA, con ácido tiobarbitúrico (TBA), lo que conduce a la formación de aductos MDA-TBA2 llamados TBARS. TBARS produce un color rojo rosado que se puede medir espectrofotométricamente a 532 nm. El ensayo TBARS se realiza en condiciones ácidas…
