La metabolómica revela el metabolismo desregulado de los esfingolípidos y los aminoácidos asociado con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad heterogénea con múltiples características patológicas, como inflamación, enfisema, bronquitis crónica y función pulmonar alterada.^1,2 Los mecanismos subyacentes son complejos y actualmente no existen biomarcadores efectivos de progresión, gravedad y mortalidad de la EPOC. Una mejor comprensión de la patogenia de cada fenotipo relacionado con la EPOC permitirá mejorar el diagnóstico y el tratamiento.

La metabolómica es una ciencia emergente que implica el análisis de metabolitos endógenos de bajo peso molecular (≤1500 Da) en una muestra biológica. El metaboloma interactúa y refleja la actividad del genoma, el epigenoma y el proteoma, pero también está influenciado por factores como la dieta, el estilo de vida y los medicamentos. Al proporcionar una instantánea de la función génica, la actividad enzimática y los cambios fisiológicos, la metabolómica puede ayudar a informar la heterogeneidad de los fenotipos relacionados con la EPOC. Si bien el análisis metabolómico de biofluidos (suero, plasma u orina) y las pruebas de espirometría de la función pulmonar pueden discriminar entre controles sanos y pacientes con EPOC, las asociaciones con fenotipos clínicos relacionados con la EPOC aún no se han caracterizado por completo.

Varios estudios de metabolómica han demostrado una desregulación metabólica en la EPOC.^3,4 Una observación común en pacientes con EPOC es la desregulación del metabolismo de los esfingolípidos. Un creciente cuerpo de evidencia indica que los esfingolípidos juegan un papel clave en la patogénesis de varias enfermedades pulmonares, como el asma, la lesión pulmonar aguda, el enfisema, la EPOC y la fibrosis quística.^5–8 Las ceramidas se generan a través de la hidrólisis por esfingomielinasas y producen esfingomielinas a través de la esfingomielina sintasa.⁹ La desregulación de los metabolitos de ceramida y esfingomielina está fuertemente asociada con la EPOC.¹⁰ Bowler et al informaron que los niveles de algunas esfingomielinas específicas, como SM (d18: 1/16: 0), se asociaron inversamente con la gravedad del enfisema, en contraste con otras esfingomielinas, como SM (d18: 1/18: 0).¹⁰ Los niveles basales bajos de esfingomielina en plasma se han asociado con peor EPOC, mientras que los niveles altos se han relacionado con la rápida progresión del enfisema.^11,12 De manera similar, los niveles de ceramidas específicas se correlacionaron inversamente con la gravedad del enfisema, especialmente Cer (d18:1/16:0).¹⁰

Además, los aminoácidos, que son los componentes básicos de las proteínas, juegan un papel vital en el metabolismo intermediario. El metabolismo activo de los aminoácidos ocurre durante el ejercicio, con niveles alterados de varios aminoácidos informados en el músculo esquelético y el plasma. Sin embargo, la evidencia respalda el metabolismo desregulado de los aminoácidos en pacientes con EPOC incluso en reposo.^13,14 lo que sugiere que un perfil anormal de aminoácidos puede ser un factor de riesgo significativo para la EPOC.

Varios estudios han investigado las asociaciones entre las características clínicas de la EPOC y el metabolismo específico en varias poblaciones.^15–18 Sin embargo, los estudios que examinan las asociaciones entre la desregulación de los metabolitos de los esfingolípidos, los perfiles de aminoácidos alterados y la EPOC en las poblaciones asiáticas son relativamente escasos. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue utilizar un enfoque específico basado en espectrometría de masas cuantitativa para determinar los niveles plasmáticos de esfingolípidos y metabolitos de aminoácidos asociados con malos resultados clínicos, incluida la tasa de disminución de la función pulmonar y el aumento del índice de enfisema determinados mediante TC de tórax. scan, en una cohorte de pacientes coreanos con EPOC.

Materiales y métodos

Diseño del estudio y población

Los participantes se dividieron en grupos con EPOC (n=120) y sin EPOC (n=80) de acuerdo con los estándares de la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica, que define la EPOC como una relación entre el volumen espiratorio forzado posbroncodilatador y el volumen vital forzado. capacidad (FEV1/FVC) de < 0,70. Doscientos participantes (132 hombres y 68 mujeres), de 50 a 89 años de edad, se inscribieron en el estudio Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica en Áreas Polvorientas (CODA),^19,20 que fue diseñado para observar los resultados clínicos de los coreanos con EPOC cerca de las plantas de cemento en las siguientes regiones: Gangneung (GN), Danyang (DY), Donghae (DH), Samcheok (SC), Yeongwol (YW) y Jecheon (JC). En este estudio se utilizaron datos y especímenes biológicos recopilados durante los exámenes de referencia del estudio CODA entre 2012 y 2016. Los participantes con cáncer conocido o sospechado o hospitalización reciente (dentro de los 3 meses) fueron excluidos del estudio; sin embargo, se incluyeron pacientes con condiciones comórbidas como aterosclerosis u otras enfermedades pulmonares.

Se realizó una entrevista médica como parte del examen inicial y los participantes completaron un cuestionario de encuesta. El cuestionario incluía factores demográficos, historial médico y de tabaquismo, factores de estilo de vida, medicamentos actuales, historial de exacerbaciones y síntomas respiratorios durante el último año. A todos los participantes se les realizó un examen físico, muestreo de sangre/orina, espirometría y tomografía computarizada (TC). Todos los participantes en este estudio dieron su consentimiento informado por escrito. Este estudio fue aprobado por el IRB del Hospital de la Universidad Nacional de Kangwon (KNUH 2020–06-007) y todos los protocolos del estudio se realizaron de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional del Hospital de la Universidad Nacional de Kangwon.

Mediciones

La espirometría se realizó con equipo estandarizado según las recomendaciones de las guías de la American Thoracic Society y la European Respiratory Society.²¹ Se realizó una espirometría antes y 15 min después de la inhalación de dos inhalaciones de salbutamol para evaluar la respuesta broncodilatadora. Los protocolos de recolección de datos en la cohorte CODA se describieron previamente en detalle. Los resultados de la espirometría se expresaron como porcentajes de los valores predichos basados ​​en la población coreana.²²

Las mediciones de tomografía computarizada volumétrica se obtuvieron utilizando un escáner de tomografía computarizada de 16 detectores múltiples (Somatom Sensation 16; Siemens Medical Systems, Bonn, Alemania), según el protocolo utilizado en el estudio de la enfermedad pulmonar obstructiva coreana (KOLD).²³ El índice de enfisema, definido como el porcentaje de área de baja atenuación en el pulmón (≤ 950 unidades Hounsfield, %LAA-950HU), y el grosor de la pared de las vías respiratorias, definido como el porcentaje del área media de la pared medida en dos bronquios segmentarios, se obtuvieron utilizando en -Software propio del estudio KOLD.

Metabolómica dirigida

Las muestras de plasma (100 μL) se mezclaron con 300 μL de cloroformo/metanol (1/2, v/v) y una solución estándar interna. El patrón interno contenía 10 μM¹³ C₅-glutamina, 0,4 μM serotonina-d₄0,6 μM dopamina-d₄2 nM triptófano-d₅6 nM serina-d₃50 nM lisina-d₈y Cer 50 nM (d18:1/17:0), y se normalizó para el método LC-MS/MS. La extracción líquido-líquido se realizó incubando la mezcla durante 15 min a 4 ℃, seguida de centrifugación a 14.000 rpm durante 15 min. La fase lipídica se recogió para la medición de esfingolípidos y se secó al vacío. La fase acuosa se utilizó para la derivatización química de aminoácidos utilizando isotiocianato de fenilo. Los aminoácidos derivatizados se extrajeron adicionalmente con acetato de amonio 5 mM en metanol y se secaron al vacío. La materia seca se reconstituyó con metanol o H₂O/acetonitrilo (50/50, v/v) antes del análisis LC-MS/MS.

Los aminoácidos y los esfingolípidos se analizaron utilizando un sistema UHPLC 1290 Infinity (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) con un sistema Qtrap 5500 LC-MS/MS (AB Sciex, Framingham, MA, EE. UU.). El volumen de inyección fue de 3 μL y las muestras se ionizaron utilizando una interfaz de pulverización de iones turbo. Para el análisis de aminoácidos, se utilizó una columna de fase inversa (Zorbax Eclipse XDB-C18100 × 2 mm; Agilent Technologies) con las fases móviles A y B que consisten en ácido fórmico al 0,2 % en H₂O y acetonitrilo, respectivamente. El caudal fue de 500 μL/min y la temperatura de la columna fue de 50 ℃. El gradiente de separación fue el siguiente: B al 0 % durante 0,5 min, B al 95 % durante 5 min, B al 95 % durante 1 min, B al 0 % durante 0,5 min y B al 0 % durante 2,5 min. Para los esfingolípidos se utilizó una columna de fase inversa (Pursuit 5 C18, 150×2,1 mm; Agilent Technologies) con fases móviles A (formiato de amonio 5 mM/MeOH/tetrahidrofurano [500/200/300, v/v/v]) y B (formiato de amonio 5 mM/MeOH/tetrahidrofurano [100/200/700, v/v/v]). El caudal de LC fue de 200 µL/min y la temperatura de la columna fue de 35 ℃. El gradiente de separación fue el siguiente: 50 % B durante 5 min, 50 a 70 % B durante 3 min, 70 % B durante 7 min, 70 a 90 % B durante 7 min, 90 % B durante 3 min, 90 a 50 % B durante 0,1 min y 50% B durante 4,9 min. Se realizó un seguimiento de reacciones múltiples en modo de iones positivos y se utilizó para la cuantificación el cromatograma de iones extraídos correspondiente a la transición específica para cada analito. El análisis de datos se realizó con el software Analyst 1.5.1.

Análisis estadístico

La comparación de las características basales entre los grupos con EPOC y sin EPOC se realizó mediante el test de Student. t-test y chi-cuadrado. Las variables categóricas se describieron como N (%). Las variables continuas se informaron como la media ± estándar…