Reflejos
FOXO3 disminuyó, mientras que LA y FBXO22 aumentaron en pacientes con NSCLC.
LA promovió la resistencia al cisplatino en NSCLC in vitro e in vivo.
SQFZ inhibió la resistencia al cisplatino inducida por LA en NSCLC mediante la regulación de FOXO3.
FBXO22 afectó la ubiquitinación de p53 para revertir el efecto inhibidor de SQFZ.
SQFZ inhibió la resistencia al cisplatino en NSCLC mediante el eje FOXO3/FBXO22/p53.
Resumen
Antecedentes
El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa el 80% de los cánceres de pulmón. La quimioterapia combinada basada en cisplatino (DDP) es el tratamiento principal del NSCLC. Debido a la resistencia al DDP, la tasa de supervivencia general a 5 años de los pacientes con NSCLC es muy baja. La inyección de Shenqifuzheng (SQFZ) es esencial para la progresión del cáncer de pulmón. Sin embargo, aún no está claro si SQFZ desempeña un papel en la resistencia al DDP en el NSCLC y su mecanismo molecular.
Métodos
Los niveles de FOXO3, FBXO22 y p53 en tejidos y células de NSCLC se evaluaron mediante RT-qPCR y Western blot. La proliferación celular y la apoptosis se analizaron utilizando ensayos de CCK-8, formación de colonias y citometría de flujo. Los niveles de lactato (LA) se evaluaron mediante ELISA. Los ensayos de indicador de luciferasa dual y ChIP validaron la relación regulatoria entre FOXO3 y FBXO22. El ensayo de inmunoprecipitación evaluó los niveles de ubiquitinación de p53. Se construyó el modelo de tumor subcutáneo de ratones desnudos. La tinción TUNEL detectó apoptosis en los tejidos y la IHC evaluó la expresión de Ki67, FOXO3, FBXO22 y p53.
Resultados
FOXO3 disminuyó, mientras que LA y FBXO22 aumentaron en pacientes con NSCLC. LA condujo a una mayor resistencia al DDP en las células A549/DDP, mientras que SQFZ revirtió este efecto al regular positivamente FOXO3. Además, FBXO22 fue un efector posterior de FOXO3 y FBXO22 afectó la ubiquitinación de p53 para revertir el efecto inhibidor de SQFZ. Luego encontramos que SQFZ inhibía la resistencia al DDP inducida por LA en NSCLC a través del eje FOXO3/FBXO22/p53. Finalmente, SQFZ reguló la resistencia al DDP mediada por LA en ratones desnudos con NSCLC.
Conclusión
SQFZ influye en la resistencia al DDP inducida por LA en el NSCLC a través de la vía FOXO3/FBXO22/p53, lo que proporciona un agente prometedor para el tratamiento del NSCLC.
Introducción
El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 80% del número total de cánceres de pulmón (1). La mayoría de los pacientes con NSCLC se encuentran en la última etapa del diagnóstico clínico y carecen de fármacos terapéuticos eficaces (2). Además, muchos pacientes con NSCLC son resistentes a la quimioterapia o radioterapia comúnmente utilizadas, lo que resulta en una baja tasa de supervivencia a 5 años.3,4,5). El cisplatino (DDP) es un fármaco antitumoral de NSCLC de uso común en la práctica clínica. Tiene un amplio espectro anticancerígeno y un efecto sinérgico con una variedad de fármacos antitumorales (6). Sin embargo, el uso prolongado de DDP provocará resistencia a los medicamentos en los pacientes (7). Por lo tanto, una mejor comprensión del mecanismo y la resistencia a los medicamentos del DDP mejorará los resultados clínicos de los pacientes con NSCLC. Los tumores se oponen a los agentes quimioterapéuticos a través de una variedad de mecanismos, y las investigaciones indican que el microambiente tumoral desempeña un papel fundamental a la hora de facilitar esta resistencia.8).
Existe evidencia de que el ácido láctico (LA) es un producto derivado del microambiente tumoral, y su contenido en los tejidos tumorales es mayor que el de los tejidos normales, lo que también se correlaciona positivamente con la metástasis tumoral (9). La acumulación de LA puede provocar acidosis, angiogénesis, inmunosupresión, proliferación y supervivencia de células tumorales, lo que es perjudicial para la salud humana (10). El LA actúa como una molécula inmunorreguladora crítica involucrada en la supresión de la proliferación de células efectoras inmunes y la inducción de la desdiferenciación de las células inmunes.11). El LA secretado orquesta la activación de la expresión de la proteína MRP1/ABCC1 en el NSCLC coordinando las vías TGF-β1/Snail y TAZ/AP-1, promoviendo así la quimiorresistencia.12).
En los últimos años, el tratamiento del cáncer con medicina china se ha convertido en una característica clínica importante. La inyección de Shenqifuzheng (SQFZ) se prepara a partir de Codonopsis pilosula y Astragalus membranaceus como principales materias primas, que pueden desempeñar un papel en la promoción de la circulación sanguínea y la resolución de la estasis sanguínea (13). Un ensayo aleatorio multicéntrico indicó que la combinación de SQFZ y quimioterapia demuestra seguridad y eficacia en el tratamiento del NSCLC (14). SQFZ ejerce principalmente un efecto antitumoral y mejora la función inmune, aumentando así la calidad de vida de los pacientes con tumores (15). SQFZ puede reprogramar el microambiente inmunosupresor del melanoma in vivo para mejorar la citotoxicidad de las células inmunes infiltrantes de tumores (16). En particular, SQFZ desempeña un papel fundamental en el tratamiento del NSCLC (17). Por ejemplo, SQFZ tuvo efectos definitivos de alivio de la toxicidad en el tratamiento de pacientes mayores con NSCLC avanzado (18). Además, SQFZ podría mejorar la eficacia de la quimioterapia y la función de la inmunidad celular en pacientes con NSCLC (19). Sin embargo, no está claro si SQFZ es un agente reverso de la resistencia a la quimioterapia y el mecanismo potencial por el cual SQFZ aumenta la sensibilidad a la quimioterapia del NSCLC.
Forkhead box O3, también conocido como FOXO3 o FOXO3a, es el miembro más activo de la familia FOXO y es crucial para inhibir la formación de tumores, la proliferación celular y el metabolismo (20). Como factor de transcripción, la expresión anormal de FOXO3 se asocia con muchos cánceres, incluido el NSCLC. Por ejemplo, FOXO3 aceleró la transcripción de CASC11 para regular la progresión del NSCLC (21). Además, FOXO3 moduló nm23-H1 durante el proceso de metástasis del NSCLC (22). También se informó que el ácido láctico regulaba el nivel de m6A de FOXO3 y afectaba la expresión de FOXO3 (23). Nuestros resultados anteriores mostraron que FOXO3 tenía un sitio de unión con la región promotora FBXO22. La proteína 22 de la caja F (FBXO22), como una de las proteínas de la caja F, su eliminación conducirá a la inestabilidad del complejo de ubiquitinación, regulando así la progresión y la metástasis de los tumores (24). Curiosamente, se informó que FBXO22 sensibiliza las células de NSCLC al DDP (25). Sin embargo, la regulación de FBXO22 en NSCLC y sus mecanismos moleculares relacionados aún no están claros. P53 es un gen supresor de tumores importante y su tipo salvaje conduce a la apoptosis de las células cancerosas, previniendo así la carcinogénesis (26). En particular, FBXO22 se identificó por primera vez como un gen dirigido a p53 (27). Por lo tanto, especulamos que FOXO3 puede participar en la regulación del NSCLC a través del eje FBXO22/p53.
En este estudio se exploró el efecto de SQFZ sobre la resistencia al DDP en NSCLC. Proponemos un mecanismo novedoso en el que SQFZ regula positivamente FOXO3, lo que hace que FOXO3 inhiba transcripcionalmente la expresión de FBXO22, mientras bloquea la degradación de p53 debido a la ubiquitinación de FBXO22, lo que dificulta la proliferación y migración de células cancerosas e inhibe la resistencia al DDP en el NSCLC inducido por lactato. Por lo tanto, SQFZ puede representar una nueva estrategia terapéutica para pacientes con NSCLC a los que se les administran terapias basadas en DDP.
Materiales y métodos
Muestras clínicas
Se tomaron NSCLC emparejados y tejidos normales adyacentes (ubicados a una distancia de más de 5 cm del tumor pulmonar) de 30 pacientes que se sometieron a resección quirúrgica primaria de NSCLC entre enero de 2020 y diciembre de 2022. Ninguno de los pacientes recibió tratamiento adyuvante antes de la cirugía. Las muestras de tejido se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para su posterior análisis. También se inscribieron 30 voluntarios sanos. Recolectamos muestras de suero de pacientes con NSCLC y controles sanos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos.
Cultivo y tratamiento celular.
Se adquirieron líneas celulares de NSCLC humano (A549, H1975) de Procell (Wuhan, China) y se propagaron en medio RPMI 1640 enriquecido con FBS al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y 100 µg/ml de penicilina-estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) a 37 °C con CO2. Se establecieron células resistentes a DDP (A549/DDP, H1975/DDP) mediante cultivo continuo durante 8 meses en la selección de DDP (Sigma) de 0,3 a 20 µg/ml. Para preservar el fenotipo resistente a los medicamentos, se agregaron 2 µg/ml de DDP al medio de cultivo. Las condiciones de acidosis láctica se generaron agregando ácido L-láctico puro (Solarbio, Shanghai, China) en medio de cultivo normal hasta el nivel final de ácido láctico de 0 a 30 mM. SQFZ (no. de norma nacional de medicamentos: WS3-387(Z-50)-2003(Z)) se obtuvo de Livzon Pharmaceutical Corporation (Guangdong, China). Se preparó una solución concentrada de 10 mL, que correspondieron a 5 g de Codonopsis pilosula y 5 g de fármaco crudo de Astragalus membranaceus. Las células se trataron con SQFZ con diferentes concentraciones de 0, 50, 100, 200 mg/ml, respectivamente. Para el tratamiento con MG132, las células se trataron con MG132 (30 µM, Sigma) durante 6 h.
Transfección celular
Sangon Biotech (Shanghai, China) sintetizó el vector vacío y los plásmidos que contenían FBXO22 (oe-FBXO22) y p53 (oe-p53) sobreexpresados. shRNA específicos contra FOXO3-1 (sh-FOXO3-1), FOXO3-2 (sh-FOXO3-2), FOXO3-3 (sh-FOXO3-3) y FBXO22 (sh-FBXO22) y shRNA controlado (sh-NC) fueron adquiridos en Ribobio (Guangzhou, China). La transfección se realizó utilizando Lipofectamine™2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante durante 48 h.
PCR cuantitativa en tiempo real
Se adoptó el reactivo TRIZOL (Invitrogen) para extraer el ARN total de tejidos o células. La transcripción inversa se realizó utilizando un kit de síntesis de ADNc (Toyobo, Osaka, Japón). El ADN se cuantificó mediante Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) en el sistema de detección de PCR en tiempo real LC480 (Roche, Basilea, Suiza). Las secuencias de cebadores son las siguientes: FOXO3 F: 5′-CGGACAAACGGCTCACTC-3′, R: 5′-GGACCCGCATGAATCGACTAT-3′; FBXO22 F: 5′-ATGGGATCAGGTAGCAATCGAC-3′, R: 5′-CCACACGAAGTTCAGGGTTATC-3′; p53 F: 5′-GCAACTATGGCTTCCACCTG-3′, R: 5′-CAGAGAGCACCGCGACCACG-3′. El análisis de los datos se realizó mediante el método 2−∆∆Ct. Se utilizó GAPDH como referencia interna.
mancha occidental
La proteína total se extrajo utilizando tampón de lisis RIPA (Beyotime, Shanghai, China). Las concentraciones de proteínas se probaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime). Se cargó la misma cantidad de proteína en…
