Resumen
Antecedentes
HADV-7 es un patógeno prevalente que puede causar neumonía severa en los niños. Estudios anteriores han demostrado un aumento significativo en los niveles séricos del factor de permeabilidad vascular (VPF/VEGF) y la carga viral en pacientes pediátricos con infección fatal de HADV-7, lo que sugiere un daño potencial al endotelio vascular pulmonar. Se necesita más investigación para dilucidar el mecanismo subyacente.
Métodos
La línea celular endotelial microvascular pulmonar humana-5A-5A y los ratones CD46 humanos se usaron para experimentos in vitro e in vivo, respectivamente. RNA-seq se empleó para el análisis correlativo de ómics. La infección viral y el estado de la copia se examinaron utilizando microscopía electrónica de transmisión para observar partículas de virus, inmunofluorescencia para detectar la proteína viral hexon y QPCR para evaluar las copias del gen de fibra HADV-7. Se emplearon varios métodos, incluidos ELISA para VEGF y otros marcadores de lesiones, el ensayo CCK8 para la viabilidad celular y la citometría de flujo para los números de endotelio, para evaluar el daño endotelial. La gravedad de la lesión pulmonar aguda se evaluó puntuando la inflamación patológica y la medición de la permeabilidad vascular pulmonar. La activación de la autofagia se evaluó observando autofagosomas y validando las proteínas marcadoras.
Resultados
El análisis GSEA mostró un enriquecimiento significativo de conjuntos de genes relacionados con funciones endoteliales (barrera, defensa y regeneración) y ALI en el grupo infectado con HADV-7. El análisis GO indicó un enriquecimiento de vías relacionadas con la autofagia vinculadas a la muerte celular. Posteriormente, se observaron signos exitosos de infección y replicación de HADV-7 en el endotelio, incluidos los efectos citopáticos, los viriones intracelulares y el aumento de las copias del gen de fibra HADV-7. La lesión endotelial, incluido el daño mitocondrial, la disminución del endotelio y los niveles elevados de marcadores de lesiones endoteliales, como VEGF, SICAM-1, SVCAM-1, E-selectina, ESM1, MCP1 e IL1β, se observaron después de la infección por HADV-7. Además, se observó evidencia de vasos sanguíneos pulmonares con fugas y ALI, que incluye pérdida de peso progresiva, permeabilidad vascular pulmonar elevada y consolidación pulmonar severa. Además, la infección por HADV-7 indujo la formación de autofagosomas en el endotelio y desencadenó la autofagia de células completa. Es importante destacar que la inhibición del flujo autofágico redujo los niveles de VEGF y otros marcadores de lesiones endoteliales, disminución de la carga viral, mejoró la tasa de supervivencia celular, la fuga de vasos pulmonares aliviados e inflamación pulmonar mitigada.
Conclusiones
HADV-7 infecta con éxito el endotelio vascular pulmonar y se reproduce de manera efectiva, causando lesiones en el endotelio, la alta expresión de VEGF y la carga viral en el suero, así como el ALI/ARDS. Los inhibidores de la autofagia pueden aliviar la lesión endotelial, inhibir la replicación viral, aliviar la fuga de la vasculatura y reducir la inflamación pulmonar.
Introducción
El adenovirus humano tipo 7 (HADV-7) es un patógeno frecuente que causa neumonía grave adquirida en la comunidad en niños, contribuyendo significativamente a la mortalidad infantil asociada con la neumonía (1). Los niños son altamente vulnerables y contagiosos, a menudo conduciendo a complicaciones graves, como lesión pulmonar aguda/síndrome de dificultad respiratoria aguda (ALI/ARDS) y viremia (2, 3), planteando una amenaza significativa para su vida y salud. Estudios anteriores se han centrado principalmente en el impacto de la infección por HADV-7 en las células epiteliales alveolares, con un conocimiento limitado sobre su efecto sobre las células endoteliales vasculares pulmonares. Particularmente durante las infecciones fatales de HADV-7, el virus no solo se dirige a las células epiteliales alveolares sino que también daña las células endoteliales vasculares pulmonares, comprometiendo la función de las células endoteliales vasculares pulmonares ((4, 5).
El endotelio microvascular pulmonar es una monocapa continua metabólicamente activa de las células endoteliales escamosas responsables del intercambio de sustancias entre los tejidos y la sangre. Desempeña roles cruciales en el mantenimiento de las propiedades de la integridad de la barrera, las propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antitrombóticas, la regulación del tono vascular y el control de la hemostasia. El daño a estas células puede provocar una interrupción de glicocalic/barrera, mayor inflamación, muerte celular, formación de trombos y estrés oxidativo (6). Los estudios han demostrado que la secuenciación de células unicelas del tejido pulmonar de ratón infectado con el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) y los virus de la influenza ha identificado daño en las células endoteliales en la vasculatura pulmonar (7, 8). Además, los casos graves de infección SARS-CoV-2 y los hallazgos de la autopsia han indicado interrupciones en barreras endoteliales pulmonares extra como la barrera hematoencefálica, la barrera de sangre intestinal y la membrana de filtración glomerular (9, 10). La infección severa SARS-CoV-2 puede causar daño endotelial, lo que permite que el virus ingrese al torrente sanguíneo del tejido pulmonar y resulte en sepsis viral, que actualmente es un foco de investigación (10, 11). Algunos medicamentos dirigidos a las células endoteliales han demostrado tasas de mortalidad reducidas en pacientes con enfermedad del virus de la corona-19 (Covid-19) (12). Dirigir la lesión de las células endoteliales es crucial para mejorar los resultados de las infecciones graves del virus respiratorio. Sin embargo, hay una falta de datos integrales sobre el daño endotelial pulmonar causado por la infección grave de HADV-7, enfatizando la necesidad de una mayor investigación.
Nuestro estudio anterior descubrió un aumento notable en el VEGF en suero y la carga viral en niños con infección fatal de HADV-7 (13), lo que indica que la infección severa de HADV-7 puede causar daño a las células endoteliales vasculares y provoca una mayor permeabilidad vascular. Para investigar más a fondo este fenómeno, empleamos modelos in vitro utilizando células Hulec-5A y modelos in vivo utilizando ratones HCD46. Nuestro objetivo era explorar cómo el daño de las células endoteliales pulmonares influye en la regulación positiva de la expresión de VEGF, la carga viral sérica elevada y el desarrollo de ALI/ARDS después de la infección severa de HADV-7. Además, profundizaremos en el mecanismo subyacente detrás de estos efectos observados, proporcionando nuevas ideas para mejorar los resultados adversos relacionados con las infecciones fatales de HADV-7.
Materiales y métodos
Línea celular
Las células Hulec-5A fueron adquiridas del Banco Celular de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). Las células se cultivaron en un medio especializado (Procell, CM-0565) diseñado para un crecimiento óptimo de células Hulec-5A a 37 ° C con CO2 al 5%.
Cepa HADV-7
La cepa HADV-7 (CQ45_2019, MT113943) se obtuvo de aspirados nasofaríngea de un paciente pediátrico con neumonía adenoviral. La cepa se cultivó en células A549, purificadas (14), y cuantificado (15, 16) Uso de procedimientos estándar, lo que resulta en una concentración de stock de 3 × 1011 partículas virales por mililitro.
Modelo animal
Los ratones HCD46 (C57BL/6 J) se obtuvieron de Cyagen Biotechnology Co., Ltd (Suzhou, China) y se albergaban en una instalación específica libre de patógenos en el Centro Experimental de Animales de la Universidad de Medicina Chongqing. Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de luz-dark de 12 h, con una humedad de 55 ± 5% y una temperatura de 23 ± 1 ° C, y se proporcionó con acceso ad libitum a alimentos y agua. Antes de la infección con HADV-7 (80 μl/ratón, goteo nasal) (17), los ratones homocigotos HCD46 (de 6 a 8 semanas de edad) se pretrataron con inyecciones intraperitoneales de rapamicina (Rapa, MedChemExpress, Hy-17589a), 3-metiladenina (3MA, MedChemexpress, HY-19312) y cloroquise (CQ, MedChemExXpress, HyChemexXpress. -17589a) Una hora. Los ratones infectados simulados recibieron tratamiento PBS para la comparación. RAPA se disolvió en una mezcla que contenía 2% de DMSO (Sigma-Aldrich) y PEG300 y entre una concentración de 2.5 mg/ml y se inyectó a una dosis de 6 mg/kg (18). 3MA se disolvió en PBS a una concentración de 4 mg/ml y se administró a una dosis de 30 mg/kg (19), mientras que CQ se disolvió en una mezcla que contenía 2% de DMSO (Sigma-Aldrich), PEG300 y Tween a una concentración de 2.5 mg/ml y se inyectó a una dosis de 60 mg/kg (18). Con respecto al momento de la recolección de muestras, durante el estudio anterior sobre la construcción de un modelo de lesión pulmonar aguda en ratones HCD46 infectados con HADV-7, observamos que la inflamación, la pérdida de peso y la actividad reducida fueron evidentes en el primer día después de la infección. Para el tercer día, se observaron inflamación pulmonar severa, menor peso corporal, hipotermia y mortalidad. Desde el quinto a 7º día después de la infección, se observó una resolución gradual de inflamación pulmonar junto con la recuperación del peso corporal y la actividad del ratón. Basado en estos hallazgos empíricos, optamos por recolectar muestras en el día 3 después de la infección (17, 20).
Construcción y secuenciación de la biblioteca de extracción de ARN
El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Thermos Fisher, 15596018) siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras se congelaron flash en nitrógeno líquido durante 30 minutos y se enviaron sobre hielo seco a LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China) para el análisis de secuenciación del transcriptoma. La cantidad y la pureza total de ARN fueron el análisis del kit Bioanalyzer 2100 y RNA 6000 Nano Labchip (Agilent, CA, EE. UU.), Se usaron muestras de ARN de alta calidad con número RIN> 7.0 para construir la biblioteca de secuenciación. El ARNm se purificó a partir de 5 μg de ARN total usando Dynabeads Oligo (DT) (Thermos Fisher, CA, EE. UU.) Con dos rondas de purificación. El ARNm purificado se fragmentó en piezas cortas usando cationes divalentes a 94 ℃ durante 5–7 minutos con módulo de fragmentación de ARN de magnesio (NEB, MA, EE. UU.). Estas piezas de ARN fragmentadas se transcribieron inversa en ADNc usando la transcriptasa inversa SuperScript ™ II (Invitrogen, CA, EE. UU.). El tamaño promedio de inserto de las bibliotecas finales de ADNc fue de 300 ± 50 pb. Finalmente, la secuenciación de extremo emparejado de 2 × 150 pb (PE150) se llevó a cabo en un Illumina Novaseq ™ 6000 por LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China) después del protocolo recomendado del proveedor.
Análisis de enriquecimiento de genes de expresión diferencial (DEG) y GO
El análisis de DEGS se realizó mediante el software DESEQ2 (versión 1.26.0) entre dos grupos diferentes (y por un edger entre dos muestras). Los genes con el parámetro de la tasa de descubrimiento falso (FDR) por debajo de 0.05 y el pliegue absoluto …
(Tagstotranslate) HADV-7 (T) Autofagia endotelial (T) Lesión del endotelio (T) Viremia (T) ALI/ARDS (T) Sistema de neumología/respiratorio
