Resumen
Antecedentes
Investigaciones anteriores han revelado el impacto potencial de los ritmos circadianos en las enfermedades pulmonares; sin embargo, la conexión entre el factor embrionario tirotrófico (TEF) asociado al ritmo circadiano y la hipertensión arterial pulmonar (PAH) sigue sin estar clara. Nuestro objetivo es evaluar la relación causal genética entre TEF y PAH mediante la utilización de dos conjuntos de variables instrumentales genéticas (IV) y estudios de asociación de todo el genoma de la hipertensión arterial pulmonar (GWAS) disponibles públicamente.
Métodos
Para realizar este estudio de RM de dos muestras se utilizó un total de 23 IV genéticos de TEF independientes de informes recientes de RM y PAH GWAS, incluidos 162 962 individuos europeos. Se utilizaron experimentos de ganancia y pérdida de función para demostrar el papel del TEF en la HAP.
Resultados
Nuestro análisis reveló que a medida que los niveles de TEF aumentaban genéticamente, había un aumento correspondiente en el riesgo de HAP, como lo demuestra la IVW (OR = 1,233, IC del 95 %: 1,054–1,441; P = 0,00871) y la mediana ponderada (OR = 1,292, IC del 95% para OR: 1,064–1,568; P = 0,00964) métodos. Además, la regulación positiva de la expresión de TEF se asoció con una probabilidad significativamente mayor de ritmo circadiano anormal (IVW: P = 0,0024733, β = 0,05239). Sin embargo, no observamos una correlación positiva significativa entre el ritmo circadiano y la HAP (IVW: P = 0,3454942, β = 1,4980398). Además, nuestros experimentos in vitro demostraron que el TEF se sobreexpresa significativamente en las células del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC). Y la sobreexpresión de TEF promueve la viabilidad de PASMC y la capacidad migratoria, además de regula positivamente los niveles de citoquinas inflamatorias.
Conclusión
Nuestro análisis sugiere una relación causal entre los niveles genéticamente elevados de TEF y un riesgo elevado tanto de HAP como de ritmo circadiano anormal. En consecuencia, los niveles más altos de TEF pueden representar un factor de riesgo para las personas con HAP.
Introducción
La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una condición patobiológica, definida por la hemodinámica como una elevación de la presión promedio de la arteria pulmonar superior a 25 o 30 mmHg en reposo.1,2,3). Representa una enfermedad vascular pulmonar crónica rara y grave. Los tipos más comunes de HAP incluyen la HAP idiopática y la HAP asociada con enfermedades del tejido conectivo (4). Los síntomas de la HAP carecen de especificidad, lo que provoca un retraso de meses o incluso años desde el inicio de los síntomas hasta el diagnóstico.5). En particular, incluso el esfuerzo menor puede provocar síncope frecuente en pacientes con hipertensión pulmonar, lo que indica claramente una alta tasa de mortalidad por HAP potencialmente mortal.6). Actualmente, el enfoque terapéutico para la HAP tiene como objetivo rectificar el desequilibrio entre la actividad vascular y los mediadores vasodilatadores mientras se restaura la función de las células endoteliales.7). Y los tratamientos farmacológicos tradicionales incluyen análogos de prostaciclina, inhibidores de la fosfodiesterasa (PDE) -5, antagonistas del receptor de endotelina y activadores de cGMP (8,9,10). A pesar de algunos avances en el tratamiento de la HAP, sigue siendo una enfermedad excepcionalmente grave que plantea desafíos en el diagnóstico, tratamiento y prevención. Claramente, se justifica realizar más investigaciones para identificar los factores de riesgo que conducen a la hipertensión pulmonar y evaluar a los pacientes de alto riesgo, permitiendo una prevención oportuna y una intervención temprana.
El factor embrionario tirotrófico (TEF) es un factor de transcripción regulador crucial dentro de la vía del ritmo circadiano. TEF se combina con varios otros activadores de transcripción importantes asociados con los ritmos circadianos en el sitio promotor de la caja D para mejorar la transcripción de numerosos genes controlados por el reloj y genes fundamentales dentro del circuito central de retroalimentación del ritmo circadiano, como NR1D1, NR1D2, PER y CRY. (11, 12). Cada vez hay más pruebas que sugieren que la función pulmonar está significativamente influenciada por los ritmos circadianos (13). Se cree ampliamente que la alteración del reloj biológico, ya sea causada por factores genéticos o ambientales, es percibida por los organismos como un factor estresante y puede tener efectos tanto a corto como a largo plazo en la salud, aumentando el riesgo de enfermedades pulmonares y metabólicas. síndrome (13). Hasta la fecha, la investigación sobre los ritmos circadianos ha revelado cómo desempeñan un papel en la patogénesis de diversas enfermedades, incluido el cáncer, la enfermedad de Alzheimer y las enfermedades cardiovasculares (14,15,16). Sin embargo, actualmente no hay evidencia que sugiera una conexión entre TEF y PAH.
La investigación observacional a menudo presenta limitaciones inherentes derivadas de factores como errores de medición, posibles sesgos y la posibilidad de causalidad inversa. El análisis de aleatorización mendeliana (MR) es un enfoque genético utilizado para evaluar variables y normalmente aprovecha los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) para revelar relaciones causales entre un fenotipo determinado y su resultado resultante.17). En este estudio, validamos la asociación entre TEF y HAP mediante un análisis de aleatorización mendeliana, proporcionando conocimientos y objetivos terapéuticos novedosos para el tratamiento de la HAP.
Métodos
Fuentes de datos
Los conjuntos de datos de ratas PAH presentados en nuestro estudio se pueden encontrar en la base de datos Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA732522/). Y las muestras de CTEPH se obtuvieron de TCGA (GSE221511). Los datos resumidos del estudio de asociación de todo el genoma (GWAS) utilizados en este estudio se obtuvieron de la base de datos IEU GWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Esta investigación se llevó a cabo en una población europea e implicó la extracción de datos relacionados con «TEF» y «PAH» de conjuntos de datos GWAS. Y la información específica se proporciona en la tabla 1.
Tabla 1 Estudio de asociación de todo el genoma (GWAS) de hipertensión arterial pulmonar (HAP) y FTEmesa de tamaño completoAnálisis de aleatorización mendeliana.
En este estudio, se empleó un enfoque de aleatorización mendeliana bidireccional utilizando un análisis de variables instrumentales de dos muestras para evaluar la relación causal entre FTE y HAP. Las variables instrumentales se eligieron a partir de factores de exposición. Posteriormente, aplicamos el método de agrupamiento PLINK con un umbral de agrupamiento (r2 <0,001, kb = 100) para eliminar los SNP con sesgo debido al desequilibrio de ligamiento (LD), y los SNP de baja calidad se eliminaron en función de las frecuencias alélicas y los alelos incompatibles. Sólo conservamos aquellos SNP que mostraron asociaciones significativas con los fenotipos de "TEF" y "PAH".
Prueba de pleiotropía y heterogeneidad.
Para evaluar la heterogeneidad y probar los efectos de la pleiotropía, empleamos tres métodos de RM diferentes, incluida la varianza inversa ponderada (IVW), la RM de Egger y la mediana ponderada, siendo IVW un enfoque analítico ampliamente aceptado. Además, realizamos la prueba estadística Q de Cochran para evaluar la heterogeneidad, donde una menor heterogeneidad indica resultados de RM más confiables. La evaluación de la pleiotropía horizontal se realizó utilizando el algoritmo MR Egger, y también realizamos un análisis de sensibilidad sin incluir para evaluar la influencia de los SNP individuales en las estimaciones del efecto causal.
cultivo celular
Las VSMC primarias se obtuvieron de la aorta pulmonar de ratas SPF Sprague-Dawley (SD) (que pesaban entre 150 y 180 g) utilizando el método de explante de tejido, como se describió anteriormente (18). Las células del músculo liso vascular de rata (rVSMC) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, C11995500BT, Gibco) que contenía suero bovino fetal al 20 % (FBS, 10270-106, Gibco) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (15140-122). , Gibco). Para los experimentos se utilizaron VSMC primarias de rata de los pases 4 a 7. Las VSMC se trataron con PDGF-BB (25 ng/ml) para construir un modelo de HAP in vitro para experimentos posteriores.
mancha occidental
Recoja los tejidos de la arteria pulmonar de ratas en cada grupo y agregue tampón de lisis RIPA (Biosharp, China) que contenga inhibidor de proteína fosfatasa 1 mM para la extracción de proteínas. Luego, centrifugar las muestras a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C para obtener el sobrenadante y determinar la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (ThermoFisher Scientific). Separar las proteínas en un gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio al 10% y transferirlas a una membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Bloquee la membrana con 5% de leche desnatada a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de la incubación con el anticuerpo TEF (1:1000, PA5-106495, ThermoFisher Scientific). A continuación, lave la membrana tres veces con TBST e incúbela con el anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra (H + L) -HRP, 1:5000, ab205718, Abcam) a temperatura ambiente durante 1 h. Realizar la detección de quimioluminiscencia utilizando un sistema de imágenes ChemiDoc XRS + (Tanon, Shanghai, China). Cuantificar la proteína utilizando el software ImageJ.
inmunofluorescencia
Fijar rVSMC con 4% de PFA durante 20 minutos, luego lavar con PBS y permeabilizar las células usando 0,4% Triton X-100. A continuación, bloquee las células con BSA al 1 % durante 30 minutos, seguido de la incubación con anticuerpo α-SMA (1:1000, #48938, Cell Signaling Technology) y TEF (1:1000, PA5-106495, ThermoFisher Scientific) durante la noche a 4 °C. Posteriormente, incubar las células con anticuerpos secundarios (Goat Anti-Mouse IgG (H+L), 1:1000, ab150113, Abcam, y Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), 1:1000, 4413 S, Cell Signaling Technology. ). Finalmente, tiñe los núcleos usando Hoechst 33.258 (Sigma, 94403). Imagen de las muestras utilizando un microscopio de barrido confocal láser (Olympus FV3000, Tokio, Japón).
Ensayo CFDA-SE
Después de cultivar rVSMC en las condiciones especificadas, lave los rVSMC una vez con PBS, luego agregue la solución de trabajo CFDA-SE para lograr una concentración final de 10 m e incube a 37 ° C durante 15 a 30 minutos. Después de teñir, lave las células 3 veces con PBS y luego incubar con medio de cultivo fresco a 37 ° C durante 30 min. Finalmente, observe y analice las células teñidas utilizando un microscopio de fluorescencia.
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA)
Los niveles de IL-6 e IL-1β en las rVSMC se detectaron mediante kits ELISA (EK306 y EK301B, Multi Sciences, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de transwell
Se sembraron un total de 1 × 10^4 células/100 µL en policarbonato…
