El esputo de pacientes con discinesia ciliar primaria contiene un alto número de neutrófilos disfuncionales e inhibe la eferocitosis.

Abstracto

Antecedentes

La discinesia ciliar primaria (PCD) es un trastorno genético caracterizado por infección e inflamación recurrentes de las vías respiratorias. No existe una cura para la PCD y hasta la fecha no hay tratamientos específicos disponibles. Los neutrófilos son una parte crucial del sistema inmunológico y se sabe que son disfuncionales en muchas enfermedades inflamatorias. Hasta el momento, se desconoce en gran medida el papel de los neutrófilos en las vías respiratorias de PCD. El propósito de este estudio fue investigar el fenotipo y la función de los neutrófilos de las vías respiratorias en la PCD y compararlos con los neutrófilos sanguíneos.

Métodos

Se recolectaron muestras emparejadas de sangre periférica y esputo espontáneamente expectorado de pacientes con PCD (n = 32) y un grupo de control de pacientes con bronquiectasias sin fibrosis quística y sin PCD (n = 5). La expresión de receptores de superficie específicos de neutrófilos se determinó mediante citometría de flujo. La función de los neutrófilos se evaluó midiendo el grado de polimerización de actina, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en respuesta a estímulos activadores.

Resultados

Los neutrófilos de esputo mostraron un fenotipo altamente activado y no respondieron a los estímulos que normalmente inducirían la producción de ROS, la polimerización de actina y la expulsión de NET. Además, el esputo de PCD mostró una alta actividad de elastasa de neutrófilos y perjudicó la eferocitosis de los macrófagos de donantes sanos.

Conclusiones

Los neutrófilos del esputo en la PCD son disfuncionales y probablemente contribuyan a la inflamación continua en las vías respiratorias de la PCD. La investigación adicional debe centrarse en las terapias antiinflamatorias y la estimulación de la eferocitosis como estrategia para tratar la PCD.

Antecedentes

La discinesia ciliar primaria (PCD) es un trastorno genético que tiene una incidencia de aproximadamente 1/10.000-1/20.000 [1]. La PCD es causada por un defecto en los cilios móviles: protuberancias similares a pelos en la membrana de la célula epitelial, principalmente presentes en el epitelio respiratorio. [1]. El movimiento similar a un latido de los cilios móviles es esencial para la eliminación de la mucosidad y los patógenos del tracto respiratorio. [2]. En pacientes con PCD, las mutaciones en los genes involucrados en la formación del cilio dan como resultado una motilidad ciliar reducida o ausente y la posterior acumulación de patógenos en las vías respiratorias. [2].

Los pacientes con PCD sufren infecciones recurrentes del tracto respiratorio superior e inferior, acompañadas de síntomas característicos, como tos húmeda, infección del oído medio y obstrucción nasal. [1, 3]. Con el tiempo, la mayoría de los pacientes desarrollan bronquiectasias, lo que aumenta considerablemente el riesgo de insuficiencia respiratoria. [4].

Actualmente, no existe una cura para la PCD. La mayoría de los tratamientos disponibles no están basados ​​en evidencia y tienen como objetivo mejorar la eliminación mucociliar o suprimir la infección y la inflamación. [3, 5]. Según el modelo de vórtice vicioso, descrito por Flume et al..la bronquiectasia se mantiene por una relación compleja e interdependiente entre la disfunción epitelial, el aclaramiento mucociliar alterado, la infección crónica de las vías respiratorias y la inflamación neutrofílica persistente que conduce al daño pulmonar estructural [6]. Hasta el momento, ninguno de los tratamientos utilizados para la PCD ha tenido éxito en interrumpir el vórtice vicioso, aunque se están explorando muchos enfoques terapéuticos novedosos en la fibrosis no quística (FQ) y las bronquiectasias de la FQ [7, 8].

Investigaciones anteriores han demostrado que las vías respiratorias de los pacientes con PCD contienen cantidades elevadas de neutrófilos y citocinas proinflamatorias, incluida la principal quimiocina que atrae neutrófilos, CXCL8 [9, 10]. Tal vez de manera contradictoria, las muestras de esputo de pacientes con PCD también contenían altos niveles de interleucina 10 (IL-10), una citocina que normalmente inhibe el reclutamiento y la activación de los neutrófilos. [9, 11]. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre y son las primeras células inmunes en llegar al sitio de la infección. En condiciones normales, una vez que los neutrófilos llegan al sitio de la infección, median una poderosa respuesta antibacteriana a través de la fagocitosis, la liberación de proteasas y péptidos antimicrobianos, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la expulsión de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y la estimulación de otros mecanismos inmunitarios. células con citocinas y quimiocinas [12]. En vista del importante papel de los neutrófilos en las enfermedades inflamatorias [13]una mejor comprensión de su papel en la PCD es vital para el desarrollo de terapias antiinflamatorias.

Varias enfermedades respiratorias crónicas se caracterizan por neutrófilos disfuncionales en las vías respiratorias. Los ejemplos más notables son la fibrosis quística (FQ), las bronquiectasias no relacionadas con la FQ (un amplio grupo de enfermedades que engloba también a la DCP) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Todas estas enfermedades tienen una alta afluencia de neutrófilos que aparentemente no eliminan las infecciones bacterianas. [14, 15]. En la FQ, se ha descubierto que los neutrófilos de las vías respiratorias tienen una capacidad fagocítica más baja y una producción reducida de ROS [14]. Además, el esputo de las bronquiectasias FQ y no FQ contiene altos niveles de ADN libre y factores proinflamatorios, que pueden reducirse mediante el tratamiento con antibióticos macrólidos. [16, 17]. De manera similar, se ha informado la formación espontánea de NET por parte de los neutrófilos de las vías respiratorias en la EPOC. [18]. Juntos, estos hallazgos sugieren que los neutrófilos de las vías respiratorias en los trastornos pulmonares crónicos no logran eliminar la infección y, en cambio, dañan el tejido del huésped, lo que también está respaldado por el hecho de que las terapias dirigidas a los neutrófilos conducen a un mejor resultado de la enfermedad pulmonar en la FQ [19]. Hasta la fecha, la participación de los neutrófilos de las vías respiratorias en la progresión de la enfermedad de la PCD específicamente aún no se ha informado.

Recientemente, nuestro grupo ha demostrado que los neutrófilos de sangre periférica de pacientes con PCD exhiben una migración ineficaz y responden menos fácilmente a los estímulos bacterianos en comparación con los neutrófilos de individuos sanos. [20, 21]. Esto puede indicar que incluso antes de la migración al pulmón, los neutrófilos en la PCD muestran signos de disfunción. Sin embargo, estos hallazgos no pueden extrapolarse directamente a los neutrófilos de las vías respiratorias, ya que los neutrófilos experimentan cambios significativos al migrar de la sangre al tejido. [22]. Por lo tanto, se necesita más investigación para determinar si la capacidad de respuesta reducida se extiende a los neutrófilos que se infiltran en las vías respiratorias y si se trata de un efecto primario o secundario de la mutación genética. Esta investigación nos permitirá comprender mejor la patogenia de la PCD y, con suerte, brindar objetivos para el desarrollo de nuevas terapias o la aplicación dirigida de terapias ya existentes.

En este estudio, nuestro objetivo fue caracterizar el fenotipo y la función de los neutrófilos del esputo de pacientes con PCD y compararlos con los neutrófilos autólogos de sangre periférica. Para investigar si nuestros hallazgos eran exclusivos de la PCD o típicos de las bronquiectasias en general, incluimos un grupo de pacientes con bronquiectasias sin FQ ni PCD (en adelante denominadas bronquiectasias).

Métodos

Muestras de pacientes

Entre 2017 y 2022, 32 pacientes con DCP, diagnosticados según las guías europeas, y 5 bronquiectasias idiopáticas no FQ ni DCP fueron reclutados en el Hospital Universitario de Lovaina. Cada paciente donó al menos una muestra de esputo expectorado espontáneamente y 10 ml de sangre recolectada en un tubo recubierto con EDTA (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.), con un total de 54 (PCD) + 5 (bronquiectasias no FQ) muestras Los controles sanos adultos (n = 6) reclutados en el laboratorio anfitrión solo proporcionaron una muestra de sangre.

Todos los participantes (o sus padres) firmaron un consentimiento informado. El protocolo de estudio (S57236[ML11095]) fue aprobado por el comité ético de KU Leuven/UZ Leuven.

Purificación de neutrófilos

Los neutrófilos de sangre periférica se purificaron mediante el aislamiento de neutrófilos inmunomagnéticos EasySep (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este método se basa en la selección negativa de neutrófilos utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos dirigidas contra marcadores de linaje de leucocitos y eritrocitos no neutrófilos. Este método constantemente…

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