Resumen
Antecedentes
Los macrófagos alveolares (AM) modulan la inflamación pulmonar en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lo que contribuye a su progresión. El heterodímero PPARγ/RXRα influye en la polarización AM inducida por el humo del cigarrillo (CS). Aunque los agonistas de PPARγ suprimen la polarización de macrófagos M1 inducida por CS, no se ha determinado el impacto de los agonistas de RXRα en este proceso. Este estudio exploró los efectos y los mecanismos del agonista de RXRα bexaroteno sobre la polarización de los macrófagos en un modelo de ratón EPOC.
Métodos
Se asignaron ratones C57BL/6 al grupo de control, modelo, bexaroteno o modelo + bexaroteno. El modelo de EPOC fue inducido por la exposición a CS y la inyección intraperitoneal del extracto de humo del cigarrillo (CSE), seguido de la administración intraperitoneal de bexaroteno. Además, las células MH-S se expusieron a CSE y Bexaroteno. Los tejidos pulmonares se sometieron a tinción de hematoxilina-eosina, y se evaluaron el enfisema y las puntuaciones inflamatorias. Se midieron los niveles de citocinas y los diferenciales celulares en el fluido de lavado broncoalveolar, y la polarización de macrófagos se evaluó utilizando inmunohistoquímica, citometría de flujo y QPCR.
Resultados
El bexaroteno redujo efectivamente las puntuaciones inflamatorias, los niveles de citocinas y los recuentos de neutrófilos y el enfisema mejorado y la polarización M1 de AMS en ratones modelo EPOC. Además, mientras que la exposición a CSE redujo la expresión de PPARγ y la actividad transcripcional de AMS, el bexaroteno mejoró la respuesta transcripcional de PPARγ a CSE. HO-1 se identificó como un objetivo potencial de PPARγ; Sus niveles se evaluaron en AMS, revelando que Bexaroteno mitigó la reducción inducida por CSE en HO-1. En particular, el efecto del bexaroteno fue parcialmente inhibido por el inhibidor de PPARγ.
Conclusiones
Nuestros resultados indicaron que el bexaroteno puede frenar la inflamación y la polarización M1 en la EPOC a través de la activación de la vía PPARγ/HO-1.
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un trastorno inflamatorio pulmonar caracterizado por síntomas respiratorios persistentes y limitación de flujo de aire irreversible. La EPOC sigue siendo una causa significativa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, subrayada por la proyección de la Organización Mundial de la Salud como la tercera causa de muerte en todo el mundo para 2030 (1). La etiología de la EPOC es multifactorial, ya que el humo del cigarrillo (CS) es el factor de riesgo mejor documentado. La inflamación pulmonar inducida por CS facilita el desarrollo y la progresión de la EPOC, lo que hace que sea crucial dilucidar los mecanismos subyacentes e identificar objetivos antiinflamatorios.
Los macrófagos alveolares (AM) están a la vanguardia de la defensa inmune innata pulmonar y juegan un papel fundamental en la inflamación pulmonar inducida por CS en pacientes con EPOC ((2). Los macrófagos muestran plasticidad notable y son capaces de polarizar en fenotipos distintos, es decir, macrófagos M1 proinflamatorios y macrófagos M2 antiinflamatorios. La polarización de la AM inducida por CS influye significativamente en la progresión de la enfermedad y el estado inflamatorio pulmonar de los pacientes con EPOC (3,4,5). Nuestra investigación previa demostró que CS indujo la polarización de M1, M2B y M2D de AMS (6). Además, encontramos que inhibir la polarización de M1 podría mitigar el enfisema y la inflamación pulmonar desencadenada por CS (7, 8), lo que sugiere que la modulación de la polarización AM podría ser una estrategia terapéutica antiinflamatoria viable para la EPOC.
Retinoid X Receptor alfa (RXRα) es un miembro de la superfamilia del receptor nuclear y un cuadro de factores de transcripción que modulan la expresión génica en respuesta a los ligandos. Actúa como un socio heterodimérico universal para varios receptores nucleares. Estos heterodímeros son fundamentales en la regulación transcripcional de los genes aguas abajo, y su actividad transcripcional a veces está modulada claramente por dos ligandos diferentes (9). Nuestra investigación previa reveló que el agonista de PPARγ rosiglitazona mitiga la inflamación y la polarización M1 de AMS activando la vía PPARγ/RXRα (7), que sugiere que el heterodímero PPARγ/RXRα juega un papel en la polarización de macrófagos inducida por el humo del cigarrillo. Dado que la actividad transcripcional del heterodímero PPARγ/RXRα puede modularse por ligandos PPARγ y RXRα, los ligandos RXRα pueden tener un efecto regulador en la polarización de los macrófagos inducida por el humo del cigarrillo. Los ligandos RXRα incluyen ácido retinoico 9-cis y agonistas selectivos como el bexaroteno. Curiosamente, se ha informado que el ligando RXRα bexaroteno alivia el enfisema pulmonar y la inflamación de las vías respiratorias en ratones expuestos al extracto de humo de cigarrillo intraperitoneal (CSE) (10). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el bexaroteno puede participar en la polarización de los macrófagos inducidos por el humo de cigarrillo a través de la activación de la vía PPARγ/RXRα, y este estudio investigó principalmente el impacto y los mecanismos subyacentes del bexaroteno en la polarización AM en un modelo de ratón de la COPD.
Materiales y métodos
Modelo animal y tratamiento con bexaroteno
Cuarenta y ocho ratones machos C57BL/6 (6 semanas de edad, con un peso de 18 a 22 g) fueron adquiridos de Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (Benxi, Provincia de Liaoning, China) y se asignaron aleatoriamente en cuatro grupos: Control, Modelo, Modelo, Modelo, Modelo, Modelo, Modelo. bexaroteno y modelo + bexaroteno (Fig. 1A). El modelo de ratón EPOC se generó de acuerdo con un estudio anterior con algunas modificaciones (11, 12). En el modelo y el modelo + grupos de bexaroteno, los ratones fueron sometidos a exposición pasiva a CS convencional durante 30 minutos dos veces al día, con un intervalo de 6–8 h, durante 30 días consecutivos. Esta exposición se realizó utilizando un sistema de exposición de inhalación 8050 de Hope-Med (Hope Biotechnology, Tianjin, China) con 20 cigarrillos comerciales (marca Daqianmen, que contiene 0.8 mg de nicotina, 12 mg de CO y 10 mg de alquitrán por cigarrillo) cada sesión) (13). Además, en los días 1, 11 y 21, estos ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 0.3 ml de CSE al 10%. Los grupos de control y bexaroteno se expusieron al aire fresco y recibieron una inyección intraperitoneal de 0,3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Vivacell, Shanghai, China) en los días 1, 11 y 21. Ratones en los grupos bexaroteno y modelo + bexaroteno + bexaroteno + bexaroteno se administraron una inyección intraperitoneal de bexaroteno (productos químicos de velleck, 1 mg/kg, disuelto en una relación 1: 9 de dimetil sulfóxido a solución salina normal) 30 minutos antes de cada exposición diaria de CS (14). Los ratones en los otros grupos recibieron un volumen equivalente de solvente a través de la inyección intraperitoneal. Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Ética para el uso y la atención de los animales en el Hospital Shengjing bajo el número de protocolo 2022PS202K.
Fig. 1Agrupación experimental y evaluación de enfisema. Los ratones C57BL/6 se dividieron en cuatro grupos: control, modelo, bexaroteno y modelo + bexaroteno (A). La histopatología del tejido pulmonar se analizó a través de la tinción de H&E con un aumento de 100x. La intersección lineal media (MLI) y el índice destructivo (DI) se cuantificaron entre los grupos (B). Los datos se presentan como las medias ± SDS de seis réplicas. Los experimentos se realizaron tres veces. La significación estadística se denota por * para p <0.05 en comparación con el grupo de control y # para p <0.05 en comparación con el grupo modelo
Imagen de tamaño completoAnálisis morfométrico del tejido pulmonar y puntaje inflamatorio
Los pulmones de los ratones se perfundieron con paraformaldehído al 4% a una presión H2O de 25 cm y posteriormente se fijaron en la misma solución durante 48 h. Los tejidos se incrustaron en parafina, y se prepararon secciones de 4 μm de espesor para la tinción. Estas secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) y se tomaron imágenes usando microscopía de luz. La intersección lineal media (MLI) se midió en 10 campos aleatorios por muestra para evaluar la gravedad del enfisema (7). El índice destructivo (DI) se calculó en función del método descrito (15), que implica contar el número de alvéolos destruidos versus normales bajo microscopía, y calcular el DI de la siguiente manera: Di = (número de alvéolos destruidos/número total de alvéolos) × 100%. La inflamación pulmonar se evaluó utilizando una escala de 4 puntos (1: mínima, 2: leve, 3: moderada, 4: severa) en cuatro criterios: septal alveolar, peribronquiolar, infiltrados perivasculares e hiperplasia de tejido lymfoides asociada a bronquios. Los puntajes de cada criterio en cada muestra se agregaron para cuantificar la inflamación (8).
Recuentos de células totales y diferenciales en Balf
El lavado broncoalveolar se realizó con 1 ml de PBS. El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) se centrifugó y los gránulos celulares se resuspendieron en PBS. El recuento total de células se determinó usando un hemocitómetro. Para los recuentos diferenciales, se colocaron 100 µl de la suspensión celular en portaobjetos de vidrio, se centrifugó a 1000 rpm durante 10 minutos y posteriormente se tiñeron con Wright – Giemsa para el examen microscópico.
ELISA para la medición de TNF-α, IL-1β e IL-6
Para la medición de las citocinas TNF-α, IL-1β e IL-6, el sobrenadante de la BALF se recogió después de la centrifugación y se almacenó a -80 ° C. Los niveles de estas citocinas se cuantificaron utilizando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) siguiendo el protocolo del fabricante (Boster, Wuhan, China). Los valores de densidad óptica (OD) a 450 nm se midieron utilizando un espectrofotómetro Infinite® 200 Pro (Tecan Trading AG, Suiza).
Evaluación inmunohistoquímica de iNOS y CD206
Para evaluar el estado de polarización de los macrófagos de tejido pulmonar, los marcadores de polarización M1 y M2 INOS y CD206, respectivamente, se detectaron mediante inmunohistoquímica como se describe en nuestro estudio anterior ((7, 8). Las secciones de tejido pulmonar se incubaron con anticuerpos primarios contra iNOS (AB15323) a una dilución 1: 200 y CD206 (AB300621) a una dilución de 1: 1000 (ambos de ABCAM, Reino Unido) durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, las secciones se trataron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Maixin, Fuzhou, China) a una dilución de 1: 5000 durante 2 ha temperatura ambiente. Se usó DAB para la visualización de células positivas, seguido de contratinción con hematoxilina. Las imágenes fueron …
(Tagstotranslate) COPD (T) Fumo de cigarrillo (T) Polarización de macrófagos (T) bexaroteno (T) PPARγ (T) Sistema de neumología/respiratorio
