Dirigirse a los monocitos/macrófagos pulmonares en transición como estrategias de tratamiento en enfermedades pulmonares relacionadas con exposiciones ambientales

Antecedentes

Las exposiciones ambientales/ocupacionales causan enfermedades pulmonares importantes. Los extractos de polvo orgánico agrícola (ODE) y el componente bacteriano lipopolisacárido (LPS) inducen monocitos/macrófagos pulmonares murinos reclutados y en transición, pero su función celular aún no está clara.

Métodos

RFP CCR2⁺ a los ratones se les instiló por vía intratraqueal una alta concentración de ODE (25%), LPS (10 μg) o peptidoglicano grampositivo (PGN, 100 μg) para estudios de tráfico de células de monocitos/macrófagos. Se emplearon estrategias de ratones knockout (KO) para CCR2 y administración de liposomas de clodronato intravenoso para reducir los monocitos circulantes disponibles para el reclutamiento pulmonar después de la exposición a LPS. Se recogieron tejidos pulmonares y líquido de lavado broncoalveolar (BALF). Se cuantificaron mediante ELISA las citocinas proinflamatorias y/o profibróticas, las quimiocinas y los mediadores de la matriz extracelular pulmonar. Las células pulmonares infiltrantes, incluidas subpoblaciones de monocitos/macrófagos, neutrófilos y linfocitos, se caracterizaron mediante citometría de flujo. Se cuantificaron la histopatología pulmonar, el contenido de colágeno, la vimentina y la citrulinación de proteínas postraduccional y la modificación del malondialdehído acetaldehído (MAA). Se utilizaron pruebas estadísticas paramétricas (ANOVA unidireccional, comparación múltiple de Tukey) y pruebas estadísticas no paramétricas (Kruskal-Wallis, comparación múltiple de Dunn) después de la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk.

Resultados

La instilación intratraqueal de ODE, LPS o PGN indujo fuertemente el reclutamiento de CCR2 inflamatorio⁺ CD11c^{En t}CD11b^Hola monocitos/macrófagos y ambos CCR2⁺ y CCR2⁻ CD11c⁻CD11b^Hola monocitos a las 48 h. También hubo aumentos en CCR2⁺ CD4⁺ y CD8⁺ Células T y células NK. A pesar de las reducciones en el CD11c infiltrante pulmonar inducido por LPS^{En t}CD11b^Hola células (reducción del 54%), los ratones knockout para CCR2 (KO) no estaban protegidos contra las consecuencias inflamatorias y profibróticas inducidas por LPS. En cambio, se produjeron aumentos compensatorios en los neutrófilos pulmonares y en la liberación de CCL2 y CCL7. Por el contrario, el agotamiento de los monocitos circulantes mediante la administración de liposomas de clodronato intravenoso (frente a vehículo) 24 h antes de la exposición al LPS redujo la CD11c infiltrante inducida por LPS.^{En t}CD11b^Hola subpoblación de monocitos-macrófagos en un 59% sin cambios compensatorios en otras poblaciones celulares. El pretratamiento con liposomas con clodronato redujo significativamente la IL-6 inducida por LPS (reducción del 66%), metaloproteinasas de matriz (MMP)-3 (36%), MMP-8 (57%), inhibidor tisular de metaloproteinasas (61%), fibronectina ( 38%), contenido de colágeno (22%) y vimentina (40%). La citrulinación de la proteína pulmonar inducida por LPS y la modificación de MAA, modificaciones postraduccionales implicadas en la enfermedad pulmonar, se redujeron (39% y 48%) con clodronato versus liposoma vehículo.

Conclusión

Exposiciones ambientales/ocupacionales altamente concentradas indujeron el reclutamiento de CCR2⁺ y CCR2⁻ la transición de subpoblaciones de monocitos-macrófagos y monocitos y apuntar a los monocitos periféricos puede reducir las consecuencias pulmonares adversas resultantes de la exposición a inhalantes enriquecidos con LPS.

Las enfermedades pulmonares ambientales y ocupacionales siguen siendo una causa importante de deterioro pulmonar en todo el mundo (1). Las enfermedades respiratorias crónicas, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), el asma, el síndrome similar al asma, la bisinosis, la neumonitis por hipersensibilidad y la fibrosis pulmonar, se han asociado con la exposición a polvos orgánicos. Los polvos orgánicos están compuestos de partículas, componentes de bacterias, hongos, virus, polen y fragmentos de animales y plantas (2). Estas exposiciones son comunes en la agricultura y la ganadería, la industria procesadora de granos y alimentos, las instalaciones de reciclaje y desechos, la industria textil y del algodón, la carpintería, las áreas urbanas concentradas, los edificios dañados por inundaciones y agua, y más (3,4,5,6,7). El análisis retrospectivo de la base de datos sobre la Carga Mundial de Enfermedades identificó aproximadamente 519.100 muertes y 13,6 millones de años de vida ajustados en función de la discapacidad en 2016 por enfermedades respiratorias crónicas debidas a exposiciones ocupacionales en el aire (8). La incidencia y prevalencia de la enfermedad pulmonar intersticial aumentaron de 1990 a 2019, y la exposición ocupacional se considera uno de los principales factores de riesgo a pesar de una mayor concienciación e implementación de medidas preventivas (9). Sin embargo, sigue habiendo escasez de opciones terapéuticas destinadas a acelerar la recuperación y/o prevenir enfermedades crónicas resultantes de estas exposiciones.

El lipopolisacárido (LPS) o endotoxina se encuentra en la membrana externa de las bacterias gramnegativas (10,11,12) y actúa como un componente bien definido de muchos polvos orgánicos y exposiciones ambientales que causan enfermedades. También se ha identificado un papel de los componentes de la pared celular grampositiva, como los peptidoglicanos (PGN), en la mediación de la enfermedad pulmonar tras la exposición al polvo orgánico. La creciente industrialización, la intensificación de la producción agrícola, el cambio climático y la creciente frecuencia y gravedad de los fenómenos meteorológicos extremos han conspirado para aumentar las concentraciones de partículas orgánicas en aerosol y endotoxinas ambientales (13,14,15,dieciséis). Los polvos orgánicos y sus componentes bacterianos activan vías de señalización inmune innata (es decir, receptores tipo Toll) para iniciar respuestas inflamatorias de las vías respiratorias marcadas por la afluencia de neutrófilos, linfocitos, monocitos y macrófagos con la correspondiente liberación de mediadores proinflamatorios/fibróticos (p. ej. , factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-6, quimioatrayentes, proteínas de la matriz extracelular). Los polvos orgánicos y la exposición a LPS también inducen modificaciones postraduccionales en las proteínas, que pueden servir para aumentar la inflamación y promover la fibrosis tisular (17,18,19,20). Aunque los agregados pulmonares linfocíticos inducidos por el polvo y los componentes bacterianos se redujeron en ratones con depleción de células T y B, persistieron muchas consecuencias inflamatorias. Por lo tanto, existe un interés creciente en el papel inmunopatogénico de distintas subpoblaciones de monocitos y macrófagos pulmonares reclutadas e inducidas después de exposiciones ambientales.12, 21, 22). El receptor 2 de quimiocinas con motivo CC (CCR2) es un facilitador crítico del reclutamiento y activación de monocitos a través de la interacción con su ligando de alta afinidad CCL2 (23, 24). CCR2⁺ Los monocitos desempeñan un papel crítico en el inicio de la inflamación y, al llegar al tejido inflamado, se diferencian en macrófagos fenotípica y funcionalmente distintos, capaces de modular las respuestas inflamatorias.25).

Los objetivos de este estudio fueron primero delinear la magnitud y distribución de CCR2⁺ (y CCR2⁻) monocitos y macrófagos derivados de monocitos transportados al pulmón después de exposiciones a polvo orgánico, LPS y PGN, y luego determinar si apuntar a estos monocitos-macrófagos pulmonares atenuaría las respuestas proinflamatorias y profibróticas resultantes. Probamos la hipótesis de que las respuestas proinflamatorias y profibróticas en los pulmones de ratones expuestos a LPS inhalado se reducirían en ratones con deficiencia de CCR2 (knockout) en comparación con los ratones de tipo salvaje y que se proporcionaría una protección similar en ratones de tipo salvaje a través de la administración de liposomas de clodronato intravenoso para agotar los monocitos circulantes. Comprender el papel de los monocitos reclutados y los macrófagos derivados de monocitos proporcionará conocimientos fundamentales sobre los procesos inflamatorios posteriores a exposiciones ambientales, pero también potencialmente dilucidará objetivos terapéuticos para mitigar el desarrollo de enfermedades en personas en riesgo.

Exposiciones ambientales

Lipopolisacárido (LPS) de gramnegativos Escherichia coli (O55:B5; Sigma, St. Louis, MO) sirvió como exposición principal en todos los experimentos. El fundamento fue que el LPS está disponible comercialmente y provoca una respuesta pulmonar proinflamatoria reproducible y dependiente de la dosis en humanos y roedores. En estudios de tráfico de monocitos, se realizaron comparaciones utilizando peptidoglicano (PGN) de bacterias grampositivas. Estafilococo aureus (Sigma) y una solución acuosa de extracto de polvo orgánico (ODE) preparado a partir de instalaciones de alimentación de confinamiento porcino como se describió anteriormente (26). Brevemente, el polvo de la superficie sedimentado (1 g) se incubó en solución salina equilibrada de Hank estéril (10 ml; Mediatech, Manassas, VA) durante 1 h y se centrifugó durante 30 min a 2850 x g dos veces, con el sobrenadante final esterilizado por filtro (0,22 um) para eliminar microorganismos y partículas gruesas. La ODE madre se preparó por lotes y se almacenó a -20 °C; Se diluyeron alícuotas para cada experimento hasta una concentración final (vol/vol) del 25 % en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4; diluyente). Las concentraciones de endotoxina se determinaron utilizando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (Lonza, Walkersville, MD). Los niveles de endotoxina promediaron 1,308–2,616 μg (~ 10–50 UE) para una EDO del 25 %. Estudios previos de espectrometría de masas de ODE han revelado cantidades significativas de ácido murámico (marcador de peptidoglicano) y ácidos grasos 3-hidroxi (marcador de endotoxinas), pero no de ergosterol (marcador de hongos) en comparación con el polvo doméstico (26).

Modelo de exposición animal

C57BL/6 y CCR2 homocigótico^RFP/RFP (B6.129(Cg)-Ccr2^tm2.1lfc/J) se adquirieron ratones de entre 6 y 8 semanas de edad en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). En esta última cepa (#017586; RRID:IMSR_JAX:017586), una secuencia monomérica de proteína fluorescente roja (RFP) reemplaza la secuencia codificante de la Ccr2 gen, aboliendo la función del gen y, por lo tanto, denominados ratones knockout (KO) para CCR2. Se recolectaron y enviaron recortes de cola de ratón para la extracción de ADN y el genotipado de CCR2 dirigido (TransnetYX, Cordova, TN) para confirmar CCR2 KO. Para generar CCR2 heterocigoto^{+/Solicitud de propuestas} ratones en los que CCR2 es funcional pero está marcado por la expresión de RFP, CCR2^RFP/RFP Los ratones se cruzaron con ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT). Para experimentos que utilizan CCR2 heterocigoto^{+/Solicitud de propuestas} Se utilizaron animales, ratones machos y hembras. Para CCR2 KO (y estudios de liposomas de clodronato), se utilizaron ratones machos, ya que los ratones machos tenían respuestas inflamatorias aumentadas con menos variabilidad experimental después de la exposición a LPS, de acuerdo con estudios anteriores (12, 27). Los ratones fueron aleatorizados, con AJN, AG y el personal del establecimiento animal conscientes de la aleatorización,…