Resumen
Antecedentes
Las secuelas respiratorias posteriores al covid-19 a menudo implican daño pulmonar, que se denomina anormalidades pulmonares residuales, y potencialmente conducen a problemas respiratorios crónicos. La respuesta inmune adaptativa, que involucra células T y células B, juega un papel crítico en el control de patógenos, la inflamación y la reparación de tejidos. Sin embargo, el vínculo entre la desregulación inmune y el desarrollo de anomalías pulmonares residuales sigue sin estar claro.
Métodos
109 pacientes dados de alta con anormalidades pulmonares residuales después de una COVID-19 crítica se siguieron durante 12 meses y se dividieron como pacientes de recuperación completa (FRG, n = 88) y anomalías pulmonares persistentes (Plag, n = 21). El análisis de perfil celular se realizó utilizando citometría de flujo a las 24 h de estimulación in vitro no específica de antígeno. Se evaluaron los niveles de plasma o sobrenadante de IFN-G, IL-4, IL-10, IgM e IgG, y se seleccionaron 10 pacientes (5 FRG, 5 plag) para fenotipado detallado de células inmunes y análisis funcional de células mononucleares de sangre periférica que usan citometría de flujo.
Resultados
En comparación con el grupo FRG, Plag exhibió un aumento de las células B activadas (P = 0.0317) sistémicas sin estrecho (P = 0.0159) y disminuidas en las células B doble negativas (P = 0.0317), los niveles sistémicos de IL-10 fueron más bajos, se muestran una frecuencia reducida de las células B totales y la liberación de las células B en el cultivo en la cultura espontánea (P = 0.0357) e GGG (P = 0.0079) en el cultivo. Con respecto a las células T, los pacientes con plag mostraron una reducción en las células CD4 + de la memoria efector (P = 0.0159) y un aumento en las células CD4 + TEMRA (P = 0.0079) después de la estimulación in vitro. En particular, el grupo Plag también exhibió frecuencias más altas de las células T CD4 + Th2 (GATA3 +) en respuesta a la activación que el grupo FRG (P = 0.0079).
Conclusiones
Los pacientes con anormalidades pulmonares residuales 12 meses después de la COVID-19 crítica exhiben una función deteriorada de las células B, un aumento de las células B sin estrechas y las frecuencias más altas de células T CD4 + TEMRA después de la activación in vitro. Estos desequilibrios inmunes pueden contribuir a la disfunción pulmonar en curso y garantizar una mayor investigación como un mecanismo potencial en las anormalidades pulmonares residuales. Se necesitan estudios más grandes para confirmar estos hallazgos.
Introducción
Las secuelas post-agudas de Covid-19 (PASC) son un problema de salud actual en todo el mundo; Las estimaciones indican que al menos 65 millones de personas se ven afectadas (1). PASC se define por múltiples resultados adversos después de la resolución de la infección aguda, que puede persistir durante varios meses o incluso años (2). De hecho, hasta el 70% de los pacientes hospitalizados han exhibido PASC en el primer año de recuperación (3), con el deterioro respiratorio uno de los principales resultados clínicos (4). Sin embargo, aunque las implicaciones de la activación inmune y la inflamación son clínicamente relevantes, aún no se entienden completamente. Una pregunta no resuelta es por qué los síntomas de PASC persisten durante tanto tiempo y qué papel juega el sistema inmune en este proceso.
Los informes sugieren que la persistencia de las alteraciones inmunológicas, como la redistribución de las células T mucosas, las células T CD8 + desreguladas, podría asociarse con secuelas pulmonares Covid-19 post-aguda (5, 6). Otro informe indicó que a los doce meses posteriores a la Covid-19, los pacientes muestran diferencias significativas en la capacidad de difusión para el monóxido de carbono (DLCO), con cambios que ocurren entre 6 y 12 meses después de la descarga. Además, las células T de pacientes con secuelas de pulmón y Covid largo exhiben una mayor capacidad de respuesta a los péptidos SARS-CoV-2 pero muestran características de agotamiento (7).
Algunos estudios sugieren que las secuelas de pulmón Covid-19 post-agudas podrían asociarse con el reconocimiento repetido de las proteínas SARS-CoV-2 por las células inmunes adaptativas del huésped debido a un depósito viral. Esto puede inducir la regulación negativa de la señalización del interferón del huésped y la autoinmunidad de reacción cruzada a través de autoanticuerpos preexistentes o de-Novo (8, 9). Los linfocitos B y T no actúan de forma independiente; Por ejemplo, el microambiente de citocinas generado por las células T afecta la diferenciación de las células B y, en consecuencia, la producción de anticuerpos (10).
Para aclarar la contribución de la respuesta inmune adaptativa en la patogénesis de las secuelas pulmonares Covid-19 post-agudas, particularmente en aquellas con anormalidades pulmonares persistentes (anomalías pulmonares residuales), seguimos a los pacientes dados de alta con daño intersticial Covid-19 postcrítico. A los 12 meses, algunos pacientes continuaron experimentando síntomas respiratorios, función pulmonar alterada y lesiones pulmonares intersticiales como se ve en la tomografía computarizada, mientras que otros se habían recuperado completamente. Por lo tanto, investigamos los perfiles proinflamatorios (Th1) o antiinflamatorios (Th2) y su impacto en la frecuencia y la función de las células B.
Materiales y métodos
Se remite al lector al material complementario para obtener detalles de los materiales y métodos.
Sujetos
Nuestro instituto fue un centro de atención covid-19 a una enfermedad grave o crítica durante la pandemia. Los pacientes de los sobrevivientes fueron seguidos en nuestra clínica posterior al covid implementada por el Instituto y evaluados por un grupo multidisciplinario de especialistas. 150 pacientes que tenían COVID-19 crítico (todos los pacientes requirieron ventilación mecánica invasiva) fueron dados de alta del hospital con cambios pulmonares intersticiales persistentes identificados por tomografía computarizada de alta resolución (HRCT). De estos, 32 pacientes no aceptaron participar en el protocolo de estudio, dejando a 118 pacientes inscritos. Estos pacientes fueron seguidos cada cuatro meses con pruebas funcionales pulmonares (espirometría simple, DLCO de respiración única y la prueba de caminata de seis minutos (6MWT)). A los doce meses de seguimiento, además de las pruebas funcionales, se realizó otro HRCT, obteniendo una puntuación CT (Fig. 1a).
Luego, después de un año, nueve pacientes fueron diagnosticados con daño intersticial no relacionado con CoVID-19, y fueron excluidos del estudio. Ochenta y ocho pacientes fueron clasificados como recuperados porque mostraron ≥ 80% de los valores funcionales pulmonar predichos (incluidos FVC y DLCO), sin síntomas respiratorios y TC sin anormalidades (en adelante llamado grupo de recuperación completamente (FRG)). Veintiún pacientes persistieron con síntomas, principalmente disnea en el ejercicio y la función pulmonar anormal relacionada con las anormalidades pulmonares residuales (<80% en FVC y DLCO, excluyendo patrones obstructivos como la disminución de FEV1). Este grupo mostró después de un año, disminución de DLCO y caminó metros en 6MWT, y la TC todavía muestra anormalidades pulmonares intersticiales, bandas parenquimatosas y puntaje de TC anormal (en adelante, llamado grupo de anormalidades pulmonares persistentes (plag)) (Fig. 1b). Diez pacientes con CoVID-19 fueron seleccionados al azar para evaluar el fenotipo y la función de las células inmunes, cinco de Plag y cinco de FRG (Fig. 1do); Para tener en cuenta que se usó un panel específico para el fenotipo de células T y otro para las células B (detalles en la tabla S1 en el archivo adicional). El tamaño de la muestra de cada grupo se seleccionó utilizando un tamaño de muestra calculado a partir de nuestros dos grupos de estudio (Plag vs. FRG) y consideró el DLCO a los doce meses después de la Covid-19 como el punto final primario (ver tamaño de muestra en el archivo adicional). Anteriormente, DLCO se ha asociado con alteraciones inmunes en pacientes post-covid (7). Utilizando estos datos como referencia, DLCO se eligió como el punto final primario para el análisis de potencia basado en las diferencias significativas observadas entre los grupos FRG y PLAG al inicio y el seguimiento.
Este protocolo fue aprobado por el comité ético del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Cosio Villegas (Iner, Número de protocolo C53-20 y B04-22). Todas las personas firmaron una carta de consentimiento para participar en este estudio. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki de 1964 y los estándares éticos de los comités de ética institucional.
Seguimiento del paciente y fenotipo celular. (a) Seguimiento de 150 COVID-19 pacientes dados de alta con cambios pulmonares intersticiales después de una enfermedad crítica. (b) De estos, 118 pacientes acordaron participar. Nueve fueron excluidos debido a los diagnósticos de daño pulmonar intersticial independiente de Covid. Los 109 restantes se sometieron a evaluaciones clínicas, pruebas pulmonares funcionales y tomografía computarizada de alta resolución (HRCT), lo que lleva a su clasificación en un grupo de recuperación completo (FRG, N = 88) y un grupo persistente de anormalidades pulmonares (plag, n = 21). Se midieron los niveles sistémicos de citocinas y anticuerpos y se realizó una selección aleatoria para el análisis de citometría de flujo. (do) Se evaluó la jerarquía y los fenotipos de cada población celular. Las células y el plasma para las evaluaciones se obtuvieron de pacientes 12 meses después de la descarga
Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y cultivo
Los PBMC se aislaron mediante gradiente de centrifugación estándar de Lympeprep ™ (preciso químico, Westbury, NY, EE. UU.) El cultivo PBMCS se mantuvo durante 24 h, a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 y se estimuló con anticuerpo monoclonal (MAB) anti-CD3 y CD28 (1UG/ml, BD Pharmingen) (más detalles en la tabla S1 en el archivo adicional). Los PBMC y el plasma se obtuvieron de pacientes 12 meses después de la descarga.
Tinción y análisis de citometría de flujo
Los PBMC se recuperaron y se prepararon para la citometría de flujo al final de la cultura.
Los detalles de la estrategia de análisis se observan en la Fig. S1 En el archivo adicional, y la jerarquía de subconjuntos se muestra en la Fig. 1do. Los detalles de los anticuerpos se proporcionan en la tabla S1 en el archivo adicional.
Evaluación de moléculas solubles
El plasma y los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -70 ° C hasta el uso. Interferon-gamma (IFN-G), interleucina (IL-) 4, IL-10, IgM e IgG se midieron mediante ensayo de ELISA de sándwich directo (placa inútilmente inducida por anticuerpos) (más detalles de anticuerpos en la mesa S1 en el archivo adicional).
Análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad (V 9.0.1). Los datos se muestran como valores medios y rangos intercuartiles (IQR, 25–75). De acuerdo con el número de muestras y la prueba de normalidad, el análisis estadístico se realizó utilizando un …
(Tagstotranslate) SECLEASE POSTUDE COVID-19 (T) Células T CD4 + (T) TH1/Th2 Perfil (T) Células B (T) Anticuerpos (T) Sistema de neumología/respiratorio
