Resumen
Antecedentes
Las terapias con vesículas extracelulares (EV) basadas en células madre mesenquimales (MSC) y derivadas de MSC han atraído una atención significativa como tratamientos potenciales para la enfermedad grave por coronavirus 19 (Covid-19), lo que ha llevado a su evaluación en numerosos ensayos clínicos. Este interés surge de la capacidad observada de las MSC y sus vehículos eléctricos para mitigar el estado hiperinflamatorio que caracteriza los casos graves de la enfermedad. Sin embargo, a pesar de los prometedores resultados preclínicos y clínicos iniciales, los mecanismos de acción precisos siguen sin estar claros, lo que dificulta la optimización del tratamiento.
Métodos
Este estudio investigó la respuesta de las células madre mesenquimales derivadas de la gelatina de Wharton (WJ-MSC) a un panel diverso de sueros recolectados de múltiples pacientes hospitalizados con Covid-19, con el objetivo de recapitular in vitro el espectro de condiciones inflamatorias que las MSC encuentran in vivo.
Resultados
Exposición a Covid-1 Proporcione las imágenes completas y sin recortar de geles y transferencias como tipo de archivo ‘archivo complementario’0.9 WJ-MSC activadas por suero, que aumentan la proliferación y la síntesis de ARN/proteínas. El análisis transcriptómico reveló una regulación negativa temprana y significativa de los ARN largos no codificantes (lncRNA) relacionados con la inflamación NEAT1 y MALAT1. Esta regulación a la baja de NEAT1 y MALAT1, provocada por el suero de Covid-19, sugiere un mecanismo potencial mediante el cual las WJ-MSC pueden limitar la inflamación excesiva. Es importante destacar que la reducción de la expresión de MALAT1 (y, en menor medida, NEAT1) en WJ-MSC mejoró el potencial terapéutico de los vehículos eléctricos derivados de MSC. Esto sugiere que apuntar a los lncRNA proinflamatorios en las células parentales podría ser una estrategia terapéutica prometedora para controlar el Covid-19 y otras enfermedades pulmonares inflamatorias.
Fondo
Las células madre mesenquimales (MSC) ofrecen un potencial terapéutico prometedor para la reparación de tejidos y órganos en una amplia gama de afecciones clínicas, incluidas enfermedades cardiovasculares, neurológicas, musculoesqueléticas e inmunes.1). Esta eficacia se debe principalmente a su capacidad para secretar una amplia gama de moléculas bioactivas solubles y vesículas extracelulares (VE), que facilitan la reparación de tejidos y modulan la inflamación.2, 3). En particular, los vehículos eléctricos, partículas a nanoescala que encapsulan y administran carga terapéutica como factores de crecimiento, citoquinas y ácidos nucleicos, incluidos microARN, brindan una alternativa más segura y libre de células al trasplante de MSC, mitigando los riesgos asociados con la terapia con células vivas (4).
Curiosamente, las MSC ajustan sus respuestas paracrinas dependiendo de su microambiente local, mostrando una plasticidad transcriptómica adaptativa que media las respuestas terapéuticas de estas células. El pretratamiento con citoquinas inflamatorias mejora las propiedades inmunomoduladoras de las MSC (5,6,7). Además, el cebado de citoquinas es una estrategia útil para recolectar EV antiinflamatorios derivados de MSC (MSC-EV) para aplicaciones clínicas (5, 8, 9). En el contexto de la enfermedad grave de Covid-19, caracterizada por una “tormenta de citoquinas” hiperinflamatoria, los ensayos clínicos han demostrado la seguridad y eficacia de las infusiones de MSC y MSC-EV tanto en niños como en adultos (10,11,12). Sin embargo, a pesar de los beneficios clínicos observados, los mecanismos precisos que subyacen a la eficacia terapéutica de las MSC y las MSC-EV en Covid-19 siguen sin estar claros. Esta brecha de conocimiento dificulta la optimización de estas terapias y limita la capacidad de predecir la respuesta de los pacientes.
La estimulación in vitro o cebado de MSC con suero de paciente, un enfoque previamente establecido para recrear el microambiente patológico sistémico de una serie de enfermedades, incluida la enfermedad Covid-19 (13,14,15,16) — se adoptó en este estudio para simular la señalización anormal que encuentran las WJ-MSC después de la infusión en pacientes hospitalizados con Covid-19. Aquí, presentamos la primera evidencia de que la preparación del suero de Covid-19 activa las WJ-MSC, lo que lleva a una notable regulación a la baja de dos lncRNA proinflamatorios, NEAT1 y MALAT1. Este hallazgo sugiere un posible mecanismo celular para restaurar la homeostasis, lo cual es particularmente sorprendente dado que previamente se han detectado altos niveles de estos lncRNA en muestras de pacientes con Covid-19 (17, 18). Esta regulación inversa en las MSC podría representar su respuesta adaptativa al medio inflamatorio.
Además, la eliminación de NEAT1 y MALAT1 mediada por ASO en WJ-MSC condujo a vehículos eléctricos con una capacidad mejorada para inhibir la activación de células T, lo que indica un mayor potencial inmunomodulador. Estos hallazgos contribuyen a la comprensión de los mecanismos mediante los cuales las MSC modulan la inflamación en pacientes con Covid-19 y sugieren que la focalización en lncRNA representa un enfoque terapéutico prometedor para las MSC o las terapias basadas en vehículos eléctricos.
Métodos
Pacientes y parámetros clínicos.
Se obtuvieron muestras de suero de pacientes ingresados en Neumología y/o Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) por Covid-19 entre enero y febrero de 2021 que estuvieron dispuestos a donar muestras. Se obtuvieron muestras de suero de control sano de individuos antes de la pandemia de Covid-19. No se aplicaron criterios de exclusión específicos a los pacientes de este estudio; En la Tabla complementaria 1 se proporciona información detallada sobre el paciente y el donante de control sano.
Cultura de WJ-MSC
Las WJ-MSC comerciales se cultivaron en medio de crecimiento estándar: DMEM bajo en glucosa suplementado con GlutaMAX y piruvato (Ref: 21885108; ThermoFisher), suero fetal bovino (FBS) al 10 % (Ref: A5256701, Gibco) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (p/s) (Ref: 15140122; TermoFisher).
Los microambientes fisiológicos y de Covid-19 se modelaron in vitro utilizando un medio de crecimiento estándar suplementado con un 10 % de control (para condiciones fisiológicas) o suero de paciente con Covid-19 (para condiciones de Covid-19) en lugar de FBS.
Proliferación de WJ-MSC bajo cebado sérico
Las WJ-MSC se sembraron por cuadruplicado en placas de 96 pocillos de paredes blancas con fondos transparentes a 1.000 células/pocillo en medio de crecimiento estándar. 24 h después de la siembra, las células se lavaron con PBS y se añadió a cada cuadruplicado medio de crecimiento estándar suplementado con control o suero de paciente Covid-19 al 10 % (en lugar de FBS), junto con 2x RealTime-GLO™ MT Cell Viability Assay (Promega). Las células se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 y las mediciones de viabilidad (luminiscencia emitida) comenzaron 1 h después de la adición de todos los componentes a los pocillos (día 0). Luego se midió la luminiscencia cada 24 h durante un período de 3 días. El día 4, el medio se reemplazó por un nuevo medio de crecimiento con los sueros correspondientes de controles sanos y pacientes y 2x RealTime-GLO™ MT Cell Viability Assay. Se midió la luminiscencia en la placa de muestra durante 2 días adicionales. Para todos los experimentos, las mediciones se realizaron utilizando un luminómetro de microplacas GloMax-96 (Promega, Madison, WI, EE. UU.). Las lecturas de luciferasa de MSC en medio de inanición se usaron como control en blanco y los datos obtenidos en el día 0 se usaron para normalizar las mediciones restantes. El experimento se repitió tres veces, utilizando cada vez sueros de 16 sueros de donantes de control y 15 sueros de pacientes afectados por Covid-19. Los resultados se expresan como la mediana de estos 3 experimentos independientes.
Aislamiento de secretoma
Se sembraron MSC derivadas de gelatina de Wharton (WJ-MSC) en placas de 24 pocillos a una densidad de 20.000 células por pocillo y se cultivaron en medio de crecimiento estándar completo. Después de 24 h, se eliminó el medio de crecimiento, las células se lavaron y posteriormente se cebaron con muestras de suero de Covid-19 o de control durante un período de 48 h. Después del cebado, se eliminaron los medios que contenían sueros y las WJ-MSC se incubaron en medios sin suero durante 24 h para permitir la recolección del secretoma. Luego, el secretoma recolectado se centrifugó a 2000 xg durante 5 minutos para eliminar cualquier residuo celular, y el sobrenadante se distribuyó en alícuotas y se almacenó a -80 °C para su uso posterior.
Mediciones de proteínas
El contenido de proteína en el secretoma diluido en PBS obtenido después de 48 h de cebado con sueros de control o muestras de sueros de Covid-19 y posterior inanición durante la noche se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el reactivo de trabajo se preparó mezclando el Reactivo A y el Reactivo B en una proporción de 50:1. Las muestras, incluidos los medios de inanición como control negativo y los estándares de proteínas (albúmina de suero bovino, BSA), se agregaron por duplicado a una microplaca de 96 pocillos, seguido del reactivo de trabajo preparado. Luego, la placa se incubó a 37 °C durante 30 minutos y se midió la absorbancia a 562 nm utilizando un lector de microplacas.
inmunofluorescencia
Las WJ-MSC se sembraron en portaobjetos de cámara a una densidad de 20.000 células por pocillo. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y luego se añadió medio de crecimiento estándar suplementado con 10 % de suero de control o 10 % de suero de pacientes con Covid-19 durante 48 h. Luego, las células se fijaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) usando paraformaldehído al 4%. Después de la fijación, las células se lavaron tres veces con PBS y luego se permeabilizaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con Triton X-100 al 0,2%. A continuación, las células se lavaron con PBS y se bloquearon con BSA al 3% en Triton X-100 al 0,05% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpos primarios monoclonales de ratón anti-Sec31a (BD, Ref: 612350) diluidos 1:50 en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C. Después de lavarlas tres veces con PBS, las células se incubaron con el anticuerpo secundario anti-ratón Alexa Fluor 594 (Invitrogen) diluido 1:500 en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavarlos tres veces con PBS, los cubreobjetos se montaron encima de la cámara, agregando una gota de medio de montaje con DAPI (P36966 Invitrogen) para teñir los núcleos celulares para su visualización. Finalmente, se obtuvieron imágenes de fluorescencia en microscopía confocal (ZEISS LSM880 AIRYSCAN – objetivo 20X).
Matrices de anticuerpos humanos
Se analizaron los perfiles de expresión de los factores de crecimiento en secretomas agrupados derivados de WJ-MSC preparados durante 24 h con muestras de suero Control (n = 5) o Covid-19 (n = 5) y posteriormente sometidos a inanición durante la noche. Específicamente, un anticuerpo del factor de crecimiento humano de la serie RayBio C…
