Resumen
Antecedentes
Los cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS) son modelos ex vivo con poblaciones de células pulmonares conservadas y una arquitectura tisular mantenida. Por lo tanto, los PCLS son una poderosa herramienta en la investigación respiratoria para estudiar los mecanismos moleculares que reflejan fielmente la biología del tejido completo. Sin embargo, la extracción de ARN y proteínas de alta calidad de PCLS es un desafío ya que la agarosa interfiere significativamente con el rendimiento y la pureza del material extraído. El presente estudio tuvo como objetivo optimizar el protocolo de aislamiento basado en QIAzol para la extracción de ARN, miARN y proteínas de alto rendimiento y calidad de PCLS.
Materiales y métodos
Se prepararon PCLS a partir de ratas Wistar de 10 a 15 semanas de edad y se cultivaron durante 7 días en medio Eagle modificado/mezcla de nutrientes F-12 de Dulbecco (DMEM/F-12) suplementado con FBS al 0,1%, penicilina y estreptomicina. Se midió la liberación de LDH a los medios de cultivo PCLS para determinar la citotoxicidad celular. Para seleccionar el protocolo óptimo de aislamiento de miARN/ARN, probamos dos tiempos diferentes (10 min, 2 h) y temperaturas (temperatura ambiente, 4 °C y −20 °C) de precipitación con isopropanol. Finalmente, también evaluamos el aislamiento con tampón de extracción GHCL (clorhidrato de guanidinio). Para seleccionar el protocolo óptimo de aislamiento de proteínas, probamos la precipitación de proteínas durante 10 minutos a temperatura ambiente (21 ± 1 °C) con 1,5 volúmenes de isopropanol y 3 volúmenes de acetona por 1 volumen de sobrenadante de fenol-etanol. Además, también probamos la precipitación de proteínas durante 3 h a -20 °C con 3, 5 y 7 volúmenes de acetona por 1 volumen de sobrenadante de fenol-etanol. También validamos la precipitación de proteínas con tampón de retroextracción en lugar de etanol al 100%. Para medir la eficiencia general del protocolo optimizado QIAZ-4, utilizamos pulmones de rata nativos. Los PCLS para el modelo ex vivo de inflamación alérgica se trataron con IL-13 a una concentración de 80 ng/ml.
Resultados
El protocolo de aislamiento estándar de QIAzol proporcionó ARN, miARN y proteínas con bajo rendimiento y mala calidad. Descubrimos que la precipitación con isopropanol durante 2 h a 4 °C con una alta concentración de sales aumentó significativamente el rendimiento y la calidad del ARN y miARN extraídos y proporcionó una eficiencia de qPCR aceptable (entre 90 y 110%). Sorprendentemente, la precipitación con isopropanol de 2 h a -20 ° C aumentó significativamente la eficiencia de qPCR por encima del rango aceptable (eficiencia promedio: 120,4%). En cuanto a la extracción de proteínas, encontramos que la precipitación con acetona durante 3 h a -20 ° C proporcionó el mayor rendimiento con la detección lineal de proteínas en Westen Blot. El QIAZ-4 optimizado proporcionó un rendimiento de miARN y ARN significativamente mayor en comparación con los protocolos estándar de QIAzol. También encontramos una expresión significativamente mayor de eotaxina-1 en PCLS tratados con IL-13 en comparación con los controles no tratados.
Conclusiones
En nuestro estudio, describimos un método simple basado en QIAzol para el aislamiento simultáneo de ARN, miARN y proteínas de PCLS.
Fondo
Los cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS) son modelos ex vivo generados recortando pulmones inflados con agarosa en cortes de espesor uniforme (1). Como los PCLS preservan todas las poblaciones de células pulmonares con una arquitectura tisular mantenida, son una herramienta poderosa en la investigación respiratoria para estudiar mecanismos moleculares que reflejan estrechamente la biología del tejido completo (2). Sin embargo, la extracción de ARN de alta calidad a partir de PCLS plantea un desafío, ya que la agarosa interfiere significativamente con el rendimiento y la pureza del material extraído. La contaminación del ARN con agarosa obstaculiza significativamente las técnicas estándar de biología molecular (por ejemplo, transcripción inversa, PCR en tiempo real) y métodos de alto rendimiento (por ejemplo, secuenciación de próxima generación, microarrays) que limitan el uso de PCLS en estudios respiratorios (3, 4). Los protocolos basados en columnas se utilizan predominantemente para extraer ARN de PCLS. Sin embargo, estos métodos son costosos y proporcionan un rendimiento limitado de ARN que implica la combinación de varios PCLS para un aislamiento único, lo que aumenta los costos y la cantidad de animales necesarios para el experimento. Además, los protocolos basados en columnas generalmente proporcionan sólo ARN de longitud completa (ARNm) con un límite para fracciones pequeñas de ARN (por ejemplo, miARN, piARN) que tienen un papel crucial en la patogénesis de las enfermedades respiratorias.5,6,7). Además, como la agarosa muestra propiedades fisicoquímicas similares a las del ARN, a menudo se une a columnas de sílice y coeluye con el ARN, lo que hace imposible la eliminación completa de la agarosa con protocolos de aislamiento no modificados.8). Finalmente, hasta donde sabemos, ninguno de los protocolos de aislamiento de ARN basados en columnas disponibles comercialmente permite la extracción simultánea de proteínas de PCLS, lo que limita la correlación de estas dos fracciones en análisis multiómicos posteriores.
El reactivo de lisis QIAzol es una solución monofásica de fenol y tiocianato de guanidina descrita originalmente por Chomczynski et al. (9) para el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas de una sola muestra. El aislamiento con QIAzol (o reactivos alternativos como TRIzol y TRI Reagent) es superior a otros métodos ya que proporciona un alto rendimiento de ARN, preserva pequeñas fracciones de ARN (por ejemplo, miARN y piARN) y es susceptible a modificaciones para muestras desafiantes (10). Sin embargo, el aislamiento simultáneo de ARN, miARN y proteína de PCLS utilizando QIAzol no se ha descrito previamente, ya que el protocolo estándar no está diseñado para muestras ricas en agarosa.
Por lo tanto, para superar estos desafíos, en este estudio desarrollamos un protocolo modificado y rentable basado en QIAzol que proporciona miARN, ARN y proteína puros y de alto rendimiento a partir de un solo PCLS.
Materiales y métodos
Generación de PCLS de rata.
Se sacrificaron ratas Wistar, de 10 a 15 semanas de edad, mediante una sobredosis intraperitoneal de ketamina y xilazina, y se cortó inmediatamente la vena cava inferior. La perfusión pulmonar se realizó a través del ventrículo derecho con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X tibia para eliminar la sangre de los pulmones. Luego se intubó la tráquea y se inyectó lentamente en los pulmones agarosa al 1,5 % de baja gelificación (Sigma-Aldrich) en medio Eagle modificado/mezcla de nutrientes F-12 de Dulbecco (DMEM/F-12, Thermo Fisher Scientific) y se dejó solidificar por completo. . Luego se cortaron todos los pulmones, se dividieron en lóbulos individuales y se cortaron en rodajas de 500 µm con un vibratomo VT1000s (Leica) equipado con un sistema de enfriamiento. Los tejidos pulmonares se cortaron a una frecuencia de 100 Hz y una amplitud de 1,0 mm. Se cortaron PCLS de rodajas con perforadores de biopsia de 4 mm de diámetro y se transfirieron a medio DMEM/F-12 suplementado con penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/ml) y suero bovino fetal (FBS) al 0,1% y se cultivaron. a 37 °C, 5% CO2 en atmósfera humidificada. Los PCLS se cultivaron en una placa de 96 pocillos (un PLCS por pocillo sumergido en 200 µl de medio) durante 7 días y el medio de cultivo se cambió cada 24 h.
Para inducir inflamación alérgica, PCLS (n = 3) se trataron con 80 ng/ml de IL-13 de rata (PeproTech) durante 7 días con un reemplazo de medio fresco (complementado con la misma concentración de IL-13) cada dos días. En este experimento se utilizó como control PCLS (n = 3) tratado con solución salina al 0,9% de la misma manera. En este experimento se utilizaron como control PCLS (n = 3), tratados con solución salina al 0,9% de la misma manera.
Después de eso, los PCLS se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C (PCLS individuales por tubo Eppendorf sin ningún crioprotector) para el aislamiento de ARN/proteínas. El medio de cultivo de cada pocillo se transfirió a un tubo Eppendorf y se almacenó a -80 °C para lactato deshidrogenasa (LDH).
Prueba de viabilidad de LDH
La liberación de LDH a los medios de cultivo PCLS se midió con el kit de detección de citotoxicidad (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se transfirieron suavemente 100 µl de medio de cultivo PCLS o medio libre de células (control de fondo) a una microplaca de fondo plano de 96 pocillos y se mezclaron con 100 µl de una mezcla de reacción recién preparada, seguido de una incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente ( 21 ± 1 ºC). La densidad óptica se midió a 490 nm con un lector de microplacas Asys UVM 340 (Biochrom). El control de fondo (OD media ~ 0,082) se restó de todos los datos de densidad óptica obtenidos de los medios PCLS.
Aislamiento de miARN y ARN.
Se lisaron PCLS (1 PCLS por aislamiento) en un tampón de lisis apropiado utilizando un sonicador de tejido ultrasónico (Sonoplus HD 3200, Bandelin). Para homogeneizar PCLS, utilizamos 4 ciclos de 5 pulsos al 10% de la eficiencia del sonicador. Cada aislamiento de miARN/ARN se realizó en 3 réplicas técnicas. Utilizamos 200 μl de reactivo de lisis QIAzol (Qiagen) para los siguientes protocolos: QIAZ-1 (protocolo estándar QIAzol), QIAZ-2 y QIAZ-3, y 100 μl para QIAZ-4. Las muestras se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente (21 ± 1 °C) para disociar completamente los complejos de nucleoproteínas, seguido de mezcla con cloroformo (0,2 ml de cloroformo por 1 ml de reactivo de lisis QIAzol). Luego, las muestras se incubaron durante 3 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 15 minutos a 12 000 x g a 4 °C. La fase acuosa se transfirió cuidadosamente a un tubo nuevo y se complementó con 20 μg (en un volumen de 1 μl) de glucógeno libre de ARN UltraPure (Thermo Fisher Scientific). La interfase y la fase fenol-cloroformo se guardaron para el posterior aislamiento de proteínas. Las fases acuosas de los protocolos QIAZ-2, QIAZ-3 y QIAZ-4 se complementaron adicionalmente con cloruro de sodio (NaCl) 5 M hasta una concentración final de 1,2 M. La fase acuosa del protocolo QIAZ-1 no se complementó con NaCl. . El ARN se precipitó con isopropanol (0,5 ml de isopropanol por 1 ml de reactivo de lisis QIAzol) durante 10 min a temperatura ambiente (QIAZ-1), 2 h a -20 °C (QIAZ-2) o 4 °C (QIAZ-3). y QIAZ-4). Luego, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 12000 x ga 4 ° C para precipitar el ARN, seguido de lavar el sedimento tres veces con etanol al 75%. El sedimento de ARN se secó al aire durante 5 a 10 minutos, se disolvió en 15 µl de agua libre de RNasa y se incubó en un bloque térmico a 55 °C durante 10 minutos.
Para los protocolos GHCL-1 y GHCL-2, los PCLS se lisaron en 200 μl de tampón de extracción de clorhidrato de guanidinio (GHCL) (0,1 M…
