Resumen
Antecedentes
El modelo de lesión y reparación de ácido (aire) es un modelo ex vivo de lesión y reparación pulmonar, que se estableció previamente utilizando rodajas pulmonares de precisión de ratón (PCLS). El modelo de aire proporciona un puente entre los modelos actuales en vitro e in vivo para estudiar los efectos de la lesión pulmonar en rodajas de tejido pulmonar 3D. Aquí, mostramos que el modelo de aire se puede adaptar para su uso en el tejido humano como modelo de traducción para la investigación de descubrimiento y la detección de drogas.
Métodos
Para generar PCL, el tejido pulmonar humano resecado se recubrió con hidrogel de alginato para formar una pleura artificial. El tejido pulmonar se infló mediante inyección puntual de agarosa al 3%, seguido de una generación de 450–500 µm de espesor de espesor de tejido. Un área aislada de cada rebanada se lesionó mediante una breve aplicación de ácido clorhídrico 0.1 M. Air-PCLS se lavaron y cultivaron durante 48 h antes de inmunotinción para evaluar las células proliferantes (Ki67) marcadores de células alveolares tipo II/progenitoras (HTII, PROSP-C), lipofibroblastos (ADRP) y células endoteliales (ERG). La viabilidad de las PCL se evaluó tanto por el ensayo MTT como por la tinción en vivo/muerta.
Resultados
Mostramos que los niveles de proliferación no cambian en respuesta a la lesión ácida. Sin embargo, hay un aumento significativo en el porcentaje de células positivas PROSP-C y HTII en las regiones lesionadas de Air-PCL. También identificamos poblaciones de células no epiteliales; Lipofibroblastos y células endoteliales en Air-PCL humanos, para demostrar que se pueden identificar y rastrear otros tipos de células relevantes en el aire humano (modelo de cabello).
Conclusiones
El modelo de cabello es una herramienta efectiva ex vivo para estudiar mecanismos tempranos de reparación pulmonar después de la lesión. Al establecer un área de tejido lesionado adyacente al tejido no herido, este modelo imita el patrón heterogéneo de lesión pulmonar frecuentemente presente en las enfermedades pulmonares. El modelo de cabello facilitará los estudios mecanicistas de la reparación del pulmón humano y proporciona un valioso modelo preclínico para las pruebas de drogas.
Fondo
Existe una escasez de tratamientos modificadores de la enfermedad para enfermedades pulmonares adultos, muchos de los cuales implican reparación desregulada. La falta de nuevos tratamientos se debe en parte a la necesidad de modelos de traducción más complejos que reproduzcan adecuadamente la complejidad de los pulmones in vivo. Los pulmones se componen de numerosos tipos de células que van desde componentes estructurales como las células epiteliales y endoteliales hasta las poblaciones de células inmunes, incluidos los macrófagos y los neutrófilos ((1). Además, los pulmones contienen otros componentes importantes, como la matriz extracelular (ECM), que son críticas tanto para la estructura como para la función (2). Los modelos simples de cultivo celular carecen de muchos componentes críticos de los pulmones y, en consecuencia, no reflejan con precisión el entorno in vivo. Esto ha llevado al desarrollo de modelos 3D a representar con mayor precisión el medio ambiente in vivo (3).
Los modelos 3D humanos/no animales (NAM) se han adoptado rápidamente porque reemplazan el uso de animales y mejoran la tubería de traducción (4) Sin embargo, muchos de estos NAM siguen siendo relativamente simples y en la mayoría de los casos no representan con precisión el entorno multifacético de los pulmones in vivo (5).
Las rodajas pulmonares (PCL) cortadas con precisión han surgido como herramientas versátiles para la investigación pulmonar preclínica (6). Estos explantes de tejido contienen todos los tipos estructurales y de células inmunes, así como el ECM, en sus arreglos y proporciones nativas. Crucialmente se retiene la arquitectura in vivo de los pulmones. El uso de PCL en la investigación respiratoria se ha expandido con la comprensión de que este modelo 3D puede generarse a partir de tejidos pulmonares animales o humanos, así como a partir de muestras de control y pulmón enfermo (7, 8). Además, las PCL se pueden adaptar para modelar el comportamiento pulmonar clave, como la respiración o las características de la enfermedad, como los cambios de ECM en respuesta a la fibrosis (9, 10). Estudios recientes han demostrado que las PCL son un modelo efectivo para las pruebas de drogas, por ejemplo, se han empleado PCL para identificar los efectos diferenciales de los medicamentos antifibróticos Nintedanib y la pirfenidona (6, 7, 11).
Los pulmones son relativamente inactivos durante la homeostasis y contienen poblaciones de células madre/progenitoras que residen en diferentes posiciones anatómicas y que pueden responder después de una lesión, como las células basales en las vías respiratorias y las células madre broncoalveolares en las uniones de los conductos broncoalveolares (((12). En los alvéolos, las células epiteliales alveolares tipo II (ATII) actúan como células madre facultativas que se activan después de una lesión para ayudar a restaurar el epitelio alveolar dañado (13, 14). Recientemente establecimos el modelo de aire en PCL del ratón. En este modelo, una lesión espacialmente restringida se aplica brevemente a una porción pulmonar con ácido clorhídrico (HCl). Las respuestas de reparación y regeneración alveolar que se pueden rastrear y cuantificar al etiquetar poblaciones celulares relevantes como las células ATII (15).
Aquí informamos la traducción exitosa del modelo de aire al tejido humano. El modelo de aire humano (cabello) facilitará los estudios mecanicistas de la reparación y la regeneración de los pulmones tempranos y será un modelo preclínico valioso para fines de detección de drogas.
Métodos
Generar rodajas pulmonares de precisión humana
Se obtuvieron muestras de tejido pulmonar humano adulto del biobanco de la unidad biomédica respiratoria (BRU) en el Royal Brompton Hospital (Número de referencia de ética 20/SC/0142). El tejido pulmonar se obtuvo de los pulmones resecados quirúrgicamente de pacientes con sospecha de cáncer de pulmón. Todo el tejido utilizado para PCLS se clasificó como histológicamente normal.
El tejido pulmonar se sumergió y se almacenó en suero (SF) -RPMI (Gibco, ThermoFisher Scientific; 61870010) suplementado con estreptomicina de penicilina 1% v/v (Gibco, ThermoFisher Scientific; 15140122), 0.5% V/V gentamicina (Gibco, Thermofisher Scientific; 15710064), 1510064), 151006). 0.1% de anfotericina B (Gibco, Thermofisher Scientific; 15290-018), a 4 ° C hasta la producción de PCLS dentro de las 24 h. Para sellar la pieza resecada de tejido pulmonar, antes de la inflación de agarosa, se formó una pleura artificial recubriendo toda la muestra de tejido en alginato de sodio al 3% (Sigma; W201502) seguido de cloruro de calcio al 3% (Sigma; C3306). Cuando se recubrió por completo, el tejido se transfirió a un tubo Falcon que contenía tampón helado (solución salina equilibrada de Hanks al 1% (HBSS) suplementado con estreptomicina de penicilina al 1% v/v) durante 10 minutos. Luego, el tejido pulmonar se infló con agarosa de punto de fusión al 3% (Sigma; A9414) inyectando agarosa en múltiples áreas diferentes alrededor del tejido utilizando una jeringa de 3 ml y 21 g BD Microlance ™ 3. La inyección puntual se repitió hasta que todo el tejido se infló uniformemente. El tejido pulmonar se devolvió al tampón helado entre inyecciones de puntos repetidos, para mantener el gel de agarosa y la viabilidad óptima del tejido. Para generar PCL de igual tamaño para experimentos, se eliminaron núcleos de tejido pulmonar 8 mM de la pieza inflada de tejido usando un golpe de biopsia de 8 mM (Selles Medical; BP-80 F). Los núcleos de tejido se montaron en una cortadora de tejido Compresstome® VF-510-0Z (instrumentos precisos), y las rodajas se cortaron a un grosor de 450-500 μm. Las PCL se transfirieron a placas de cultivo de 24 pocillos que contenían SF-RPMI helado suplementado con estreptomicina de penicilina al 1% v/v y se incubaron a 37 ° C con CO2 al 5% durante la noche. Los PCL se lavaron tres veces con SF-RPMI prealimentado para eliminar el exceso de agarosa, antes de comenzar los experimentos.
modelo de cabello
Usando el método descrito en Kim et al. (15), Los PCL se colocaron en el centro del pozo y se eliminaron los medios. Se recubrió un cilindro de clonación Pyrex® (Sigma; CLS31668) en un extremo con grasa de silicona estéril y se aplicó a un lado de las PCL para sellar el cilindro de clonación sobre el tejido, creando una barrera entre el sitio de lesión y el resto del tejido. Dado que los HPCL con núcleo son circulares, se usó una pluma marcadora resistente al alcohol para marcar el lado de la porción dentro del cilindro de clonación (Fig. 1a). Se añadieron 500 µl de SF-RPMI al área fuera de la región aislada y la región aislada de los PCL se lesionó agregando 100 µl de HCl 0,1 M en un gel plurónico al 15% p/v (Sigma; P2443-250G), preparado con SF-RPMI, dentro del cilindro de clonación clonante, durante 1 minuto. El gel plurónico aumentó la viscosidad de los medios que contienen ácido para ayudar a evitar que el ácido se filtre del cilindro de clonación sellado con grasa de silicona. El color del medio que contiene fenol-rojo fuera del cilindro se usó para monitorear si algún HCL se filtrara, es decir, un cambio de rosa a amarillo indicaría una fuga y el PCLS se descartaría. Después del tratamiento con HCL de 1 minuto, la región aislada se lavó cinco veces con 200 µl de SF-RPMI, asegurando que el sello entre las dos regiones no fuera perturbado. Luego se retiró el cilindro de clonación y las PCL se transfirieron a una placa de 24 pocillos que contenía SF-RPMI fresca y se cultivó a 37 ° C con CO2 al 5% durante 48 h después de la lesión.
Generación de rebanadas pulmonares de precisión humana y modelo de cabello. (a) Esquema que contiene generación de PCL que usa tejido pulmonar humano (1,2,3,4,5) y la administración de un área de lesión espacialmente restringida utilizando un cilindro de clonación (6). El área de la lesión está marcada con un punto usando una pluma marcadora resistente al alcohol (6). (b) Imágenes de PCLS de Slice WideField Totos tomadas a 10 × Aumento, que muestran células vivas (calceín AM, amarillas) y muertas (Ethidium Homodimer-1, Magenta) en control, no lesiones, metanol y rodajas con ácido 0.1 M (n = 3) (do) PLICS PCLS de corte entero de una porción con lesión con ácido 0.1 M con áreas de región no lesionada y región con lesión ácido resaltada. Las imágenes de regiones no lesionadas y con lesiones ácido se tomaron a 40x usando microscopía de campo ancho. Barras de escala: Slice entero WideField = 1000 μm. (d) Ensayo MTT que demuestra una reducción en la viabilidad de PCLS con la adición de HCl 0.1 M y tratamiento con metanol (control negativo) en comparación con el control PCL no herido (n = 3; prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparaciones múltiples de Dunn. *P <0.05)
Ensayos de viabilidad
Ensayo en vivo/muerto
La viabilidad celular se evaluó en el modelo de cabello utilizando el kit de viabilidad/citotoxicidad Live/Dead® (Thermofisher Scientific; L3224) siguiendo …
(Tagstotranslate) Tisso humano (T) Slices pulmonares de precisión (T) PCLS (T) Lesión pulmonar (T) Reparación de tejidos (T) n Modelo de biología celular (T) Progenitores (T) Proliferación (T) Sistema de neumología/Sistema respiratorio/respiratorio Sistema respiratorio
