Resumen
Antecedentes
Sirolimus, la opción de terapia para linfangioleiomyomatosis (LAM), mostró acción citostática pero no citocida, con recurrencia de la enfermedad después de la abstinencia. El objetivo de este estudio es identificar nuevos biomarcadores potenciales y estrategias terapéuticas para pacientes con LAM.
Métodos
La proteómica de marcado de TMT se utilizó para detectar las proteínas expresadas diferencialmente (DEP) en el plasma de 10 pacientes LAM y 6 controles. Los niveles plasmáticos de transferrina (TRF), ferritina (FRT) y beta2-microglobulina (B2M) se validaron en una cohorte de 30 pacientes LAM y 20 controles. La eficacia diagnóstica de TRF con/sin VEGF-D se evaluó mediante análisis de curva ROC. Los efectos terapéuticos de un inductor de ferroptosis se evaluaron tanto las células MEFS TSC2 – / – MEFS y en los modelos LAM de xenoinjerto.
Resultados
El análisis de proteómica reveló 132 Deps entre pacientes con LAM y controles, que se enriquecieron principalmente en la regulación del transporte de iones de hierro. Los pacientes con LAM habían disminuido los niveles de TRF, FRT y B2M elevados en comparación con los controles en la cohorte de confirmación (P = 0.0386, P = 0.0327 y P = 0.0155, respectivamente) que independientemente con el nivel VEGF-D o la terapia con rapamicina. TRF se correlacionó positivamente con el FEV1% predicho (r = 0.4486, p = 0.0251) y el% de DLCO predicho (r = 0.4018, p = 0.0516) de pacientes con LAM. La combinación de TRF y VEGF-D mostró un valor de diagnóstico superior en comparación con el indicador individual. El arte indujo la ferroptosis e inhibió el crecimiento en las células TSC2 – / – MEFS. En los modelos animales LAM, el arte ejerció efectos antitumorales sin un efecto adverso obvio.
Conclusiones
Los pacientes con LAM exhiben un metabolismo anormal del hierro independiente del nivel VEGF-D. El arte inductor de ferroptosis es prometedor como un enfoque novedoso terapéutico para el tratamiento de LAM.
Fondo
La linfangiolomatosis (LAM) es una enfermedad neoplásica multisistema rara que afecta predominantemente a las mujeres a la edad fértil1). Ocurre esporádicamente o como parte del complejo de esclerosis tuberosa (TSC) y afecta a aproximadamente 20.9–26.04 por millón de mujeres en todo el mundo (2, 3). Las mutaciones de línea germinal o somática de TSC1 o TSC2 se consideran la patogénesis principal para LAM. La inactivación de TSC1/TSC2 da como resultado la hiperactivación del objetivo de la rapamicina de los mamíferos (mTOR) que regula la supervivencia celular, el crecimiento y la proliferación ((1, 4). The typical pathological alteration is abnormal proliferation and invasion of smooth muscle-like cells (LAM cells), which clinically present as cystic lung destruction, spontaneous pneumothorax, renal angiomyolipomas (AMLs), retroperitoneal/pelvic lymphangioleiomyomas, chylous effusion, etc. (5). LAM es un cáncer progresivo crónico con tasas estimadas de supervivencia sin trasplantes de 94%, 85%, 75%y 64%a 5, 10, 15 y 20 años, respectivamente (6).
Las células LAM pueden secretar el factor de crecimiento endotelial vascular-D (VEGF-D), un factor de crecimiento linfangiogénico, que se sabe que promueve la linfangiogénesis anormal y la metástasis tumoral (7). En 2017, la Sociedad Americana de la Torácica/Sociedad Respiratoria Japonesa (ATS/JRS) incorporó niveles de VEGF-D mayores o igual a 800 pg/ml en criterios de diagnóstico para LAM (8, 9). En particular, la concentración de los pacientes con VEGF-D en suero en 30-40% de pacientes LAM cayó por debajo del valor de corte de diagnóstico y la biopsia pulmonar todavía es necesaria para estos pacientes sin síntomas clásicos (1, 8). Por lo tanto, buscar biomarcadores adicionales puede ayudar a implementar un diagnóstico temprano de la enfermedad.
En términos de tratamiento, Sirolimus dirigido a la vía de señalización MTOR es el único medicamento aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para LAM. La administración de Sirolimus retrasa la progresión natural de LAM. Se informa que el sirolimus puede estabilizarse o mejorar la función pulmonar, disminuir el riesgo de neumotórax, aliviar el tamaño de las AML y reducir los efusiones quilosas y los linfangiolomiomas ((10,11,12). Sin embargo, el sirolimus simplemente inhibe el crecimiento celular y la proliferación en lugar de eliminar las células LAM neoplásicas, con la recurrencia tumoral en el cese de la terapia con sirolimus (13, 14). Además, algunos pacientes tuvieron que rescindir la terapia con sirolimus debido a efectos adversos. También es de destacar que varios pacientes demuestran resistencia o mala capacidad de respuesta al sirolimus, y su función pulmonar continúa exhibiendo una disminución progresiva incluso después de la administración de rapamicina (15, 16). Por lo tanto, es necesario explorar nuevos enfoques terapéuticos para personas con LAM.
En este estudio, realizamos proteómica de marcado de TMT para comparar el perfil de proteínas de plasma entre los pacientes LAM y los controles sanos. Posteriormente, el análisis bioinformático reveló que las proteínas expresadas diferencialmente (DEP) entre los dos grupos se enriquecieron principalmente en la regulación del transporte de iones de hierro. Se sabe que el hierro es un elemento traza indispensable para mantener las actividades fisiológicas y el metabolismo del hierro ejerce una influencia importante en el proceso de ferroptosis. Como un nuevo tipo de muerte celular programada, se ha informado que la ferroptosis está conectada con la ocurrencia tumoral y la progresión y la ferroptosis dirigida se está convirtiendo cada vez más en una terapia potencial para el cáncer (17, 18). Por lo tanto, seleccionamos tres proteínas de interés relacionadas con el metabolismo del hierro para una evaluación adicional en la cohorte de validación e investigamos el impacto del inductor de ferroptosis Artesunato (ART) (19) en modelos LAM in vitro e in vivo.
Métodos
Participantes y colección de plasma
Este estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Ética del Hospital Tongji, Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (Número IRB: 20211265). El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes incluidos en el estudio. Se reclutaron 30 pacientes LAM y 20 controles sanos en el presente estudio. Los criterios de inclusión para pacientes LAM incluyeron mujeres y diagnósticos de LAM basados en la Guía de práctica clínica de la Sociedad Torácica Americana/Sociedad Respiratoria Japonesa (20). Los criterios de exclusión incluyeron infección en las últimas dos semanas o comorbilidad severa. Los controles sanos que no tenían antecedentes de enfermedad respiratoria crónica, infección dentro de dos semanas, humo, enfermedad sistémica grave o cáncer se consideraron apropiados para su inclusión. Las muestras de sangre en ayunas se recogieron en tubos de vacitainer, luego el plasma y el suero se cosecharon por centrifugación y se almacenaron a – 80 ° C.
Análisis de proteómica basado en TMT
Extracción de proteínas y digestión de tripsina.16 Se ensamblaron muestras plasmáticas (10 LAM y 6 controles) para realizar el análisis proteómico. Después de la centrifugación a 12,000 g a 4 ° C durante 10 minutos, los restos restantes se agotaron y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga. Luego, las 14 proteínas de alta abundancia de alta abundancia se eliminaron mediante el kit de columnas de giro de agotamiento de proteínas Pierce ™ Top ™ (ThermoFisher Scientific). La concentración de proteínas se determinó con el kit BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, la solución de proteína se redujo con ditiotreitol 5 mM durante 30 minutos a 56 ° C y se alquiló con yodoacetamida 11 mM durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la precipitación de proteínas con acetona precoledada, la muestra se diluyó agregando TEAB 200 mM y se digirió por tripsina durante la noche.
Etiquetado TMT y fraccionamiento de HPLC. Los péptidos de cada muestra se marcaron con el reactivo TMT (Thermofisher Scientific) y se incubaron durante 2 ha temperatura ambiente. Los péptidos marcados con TMT se mezclaron, desalaban y se secaron al vacío. Se usó un HPLC de fase inversa de pH alto para fraccionar péptidos marcados con TMT en la columna Agilent 300 extender C18 (partículas de 5 μm, 4,6 mm ID, 250 mm de longitud). Se recogieron 60 fracciones y se combinaron aún más en 6 fracciones y se secaron por centrifugación de vacío.
Análisis LC – MS/MS. Los péptidos trípticos se separaron por un sistema UPLC 1200 Easy-NLC (Thermofisher Scientific) a una velocidad de flujo de 500 nl/min. Y el gradiente de separación de 60 minutos se construyó con fase móvil A (ácido fórmico al 0,1% y acetonitrilo al 2%) y fase móvil B (ácido fórmico 0,1% y acetonitrilo al 80%). Los péptidos separados se analizaron en Q ExactivetM HF-X (ThermoFisher Scientific) a través de una fuente de iones nanoelectrospray con el voltaje de pulverización aplicado a 2.3 kV. En un modo de adquisición dependiente de datos, los 20 iones precursores principales se seleccionaron del escaneo de espectrometría de masas primaria (400–1200 m/z, 60,000 resolución), seguido de fragmentación de disociación de colisión de energía de mayor energía (HCD) para realizar la detección de espectrometría de masas secundaria. El objetivo de control de ganancia automática (AGC) se estableció en 1E5, con un umbral de intensidad de iones 5e4/sy un tiempo de exclusión dinámico de 30 s. Los espectros de MS/MS generados se procesaron usando Proteome Discoverer (V2.4.1.15). Los parámetros de búsqueda fueron los siguientes: Base de datos, Homo_Sapiens_9606_Sp_20210721.Fasta; Digestión: tripsina; Max perdió escisiones, 2; tolerancia a la masa de iones precursores, 10 ppm; Tolerancia a la masa iónica fragmental, 0.02 DA; Modificación fija, carbamidometilo (C), TMT 6 PLEX (N-Term), TMT 6 PLEX (K); modificación variable, acetilo (proteína N-terminal), oxidación (M); tasa de descubrimiento falso, 1%.
Análisis bioinformático. Simultáneamente, satisfactora el cambio de pliegue> 1.2 o el cambio de pliegue <0.83 y el valor de P <0.05 entre el grupo LAM y el grupo sano se consideraron como DEPS. Posteriormente, las proteínas identificadas se analizaron en la base de datos de ontología genética (GO) y PFAM. La red de interacción proteína -proteína (PPI) se construyó en la cadena de la base de datos en línea (v.11.0), luego los módulos clave de la red PPI se identificaron utilizando el complemento de detección de complejo molecular (MCODE) del software Cytoscape.
Validación de proteínas
Los niveles plasmáticos de beta2-microglobulina (B2M), ferritina (FRT), transferrina (TFR) se cuantificaron por inmunoturbidimetría en el analizador C701/Cobas 8000 que está disponible en el laboratorio clínico del Hospital Tongji, Universidad de Medicina de Tonguji, Universidad de Huazhong de ciencia y tecnología. El VEGF-D en suero se midió usando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas de acuerdo con el …
(Tagstotranslate) Lam (T) Metabolismo del hierro (T) TRF (T) Ferroptosis (T) Art (T) Sistema de neumología/respiratoria
