Resumen
Antecedentes
La prevalencia del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es notablemente elevada en personas diagnosticadas con fibrosis pulmonar idiopática (FPI). La fosfoproteína 1 secretada (SPP1), conocida por su participación en diversos procesos fisiológicos, incluida la oncogénesis y la fibrosis de órganos, tiene un papel ambiguo en la intersección de la FPI y el NSCLC. Nuestro estudio buscó dilucidar la función de SPP1 dentro de la patogénesis de la FPI y su impacto posterior en la progresión del NSCLC.
Métodos
Se analizaron cuatro conjuntos de datos GEO en busca de genes diferenciales comunes y se utilizó la base de datos TCGA para analizar el pronóstico. La infiltración inmune fue analizada por la base de datos TIMER. La expresión de SPP1 se examinó en tejidos pulmonares humanos, los fibroblastos de IPF y el modelo de fibrosis pulmonar de ratón inducida por BLM. En combinación con la ganancia y pérdida de función del gen SPP1, se realizaron experimentos de qRT-PCR, Western blot, EdU y CCK-8 para evaluar los efectos y mecanismos de SPP1 en la progresión de la FPI. El efecto de SPP1 sobre el NSCLC se detectó mediante el cultivo conjunto de fibroblastos de IPF y células de NSCLC.
Resultados
A través del análisis bioinformático, observamos una sobreexpresión significativa de SPP1 en conjuntos de datos de pacientes con FPI y NSCLC, lo que se correlaciona con una mayor infiltración inmune de fibroblastos asociados al cáncer en NSCLC. Se detectaron niveles elevados de SPP1 en muestras de tejido pulmonar de pacientes con FPI y modelos de ratón inducidos por bleomicina, observándose una colocalización parcial con actina del músculo liso α. La eliminación de SPP1 inhibe la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos inducida por TGF-β1 y la proliferación de fibroblastos de IPF. Por el contrario, la sobreexpresión de SPP1 promovió la proliferación de fibroblastos de FPI a través de la vía PI3K/Akt/mTOR. Además, los fibroblastos de IPF promovieron la proliferación de células de NSCLC y activaron la vía PI3K/Akt/mTOR; Estos efectos fueron atenuados por la eliminación de SPP1 en los fibroblastos de FPI.
Conclusiones
Nuestros hallazgos sugieren que SPP1 funciona como una molécula que promueve tanto la fibrosis como la tumorigénesis, posicionándola como un posible objetivo terapéutico para controlar la coexistencia de FPI y NSCLC.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) representa una enfermedad pulmonar intersticial progresiva y desconocida, caracterizada por una disnea creciente y una disminución continua de la función pulmonar. A menudo culmina en insuficiencia respiratoria, lo que lleva a la muerte dentro de los 3 a 5 años posteriores al diagnóstico.1, 2). Los datos epidemiológicos recientes subrayan una creciente incidencia de FPI, con cifras actuales en los Estados Unidos que se aproximan a 14,6 casos por 100.000 personas (3). Las características patológicas de la FPI se manifiestan principalmente como un depósito extenso de matriz extracelular y la aparición de focos de fibroblastos.4). A pesar de las investigaciones en curso, la etiología de la FPI sigue siendo enigmática y probablemente implique la activación de innumerables citoquinas. Las intervenciones terapéuticas actuales para la FPI, incluidas la pirfenidona y el nintedanib, tienen como objetivo desacelerar la progresión de la enfermedad y mitigar el deterioro de la función pulmonar. Sin embargo, no pueden revertir la fibrosis pulmonar (5, 6). En consecuencia, el trasplante de pulmón es el único tratamiento eficaz para los pacientes con FPI en etapa terminal, lo que mejora significativamente la esperanza de vida.7).
Sorprendentemente, la incidencia de cáncer de pulmón en la población general oscila entre el 2% y el 6,4%; sin embargo, en el contexto de la FPI, esta prevalencia aumenta drásticamente hasta el 2,7%-48% (8). Los estudios han demostrado que la fibrosis pulmonar es un factor de riesgo cancerígeno independiente, con regiones fibróticas pronunciadas que exhiben una mayor propensión al desarrollo de cáncer de pulmón, especialmente el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) (9, 10). En la actualidad, el mecanismo de la FPI en combinación con el NSCLC sigue sin estar claro; sin embargo, la investigación ha demostrado que muchos genes, citocinas y vías relacionadas con el NSCLC se activan en la FPI (11). Por ejemplo, la activación sostenida de fibroblastos, la remodelación de la matriz extracelular, las anomalías de los telómeros y la telomerasa y las mutaciones del gen TP53 pueden inducir FPI en combinación con cáncer de pulmón.12, 13).
Los fibroblastos, componentes fundamentales dentro del microambiente tumoral, se activan y transforman en fibroblastos asociados al cáncer (CAF) en matrices extracelulares tumorales.13). En comparación con las células tumorales normales, los CAF secretan varios metabolitos e interactúan con las células tumorales, desempeñando papeles importantes en diversos mecanismos, como la proliferación tumoral, la invasión, la metástasis y la angiogénesis.14). Además, el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), un elemento crítico dentro del entorno tumoral, facilita la activación de CAF y la producción de matriz extracelular, cultivando así un microambiente propicio para el tumor.15, 16). Un estudio anterior ha informado que la expresión elevada de TGF-β en pacientes con cáncer de pulmón presagia un pronóstico sombrío (17). Inhibir la activación y proliferación de fibroblastos podría ser una estrategia de tratamiento antitumoral y antifibrótica prometedora.
La fosfoproteína 1 secretada (SPP1) se conoce como una glicoproteína multifacética codificada en el cromosoma 4 humano (4q13.22). Pertenece a la familia de las glicoproteínas N de unión pequeña a las integrinas y se expresa de forma ubicua en huesos y diversos tejidos.18). Su funcionalidad molecular, que abarca de 41 a 75 kDa, interactúa con varios receptores de la superficie celular, lo que influye en el metabolismo óseo, la modulación inmune, la cicatrización de heridas y la progresión de tumores.19). Estudios recientes han destacado la participación de SPP1 en las actividades tumorales, incluido el crecimiento, la invasión, la migración y la resistencia a los medicamentos, con una correlación notable con el pronóstico tumoral. Liu y cols. encontraron que la expresión de SPP1 está elevada en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, y que la sobreexpresión de SPP1 promueve la proliferación, migración e invasión de tumores; inhibe la apoptosis celular; y desarrolla resistencia a cetuximab activando la vía KRAS/MEK (20). Además, SPP1 también participa en el desarrollo de la fibrosis. Lin et al. informaron que SPP1 activa la vía Akt/GSK-3β/β-catenina y que la inhibición de la autofagia promueve la fibrosis auricular (21). Sin embargo, el papel de SPP1 en la interacción de la FPI y el NSCLC sigue sin explorarse, y sus contribuciones mecanicistas a la FPI aún están veladas por la ambigüedad.
En el presente estudio, identificamos a SPP1 como un objetivo molecular crítico que interconecta la FPI y el NSCLC. SPP1 se sobreexpresó en tejidos pulmonares de pacientes con FPI y NSCLC y se asoció con el pronóstico del NSCLC. Además, nuestros hallazgos demuestran que la eliminación de SPP1 impide la activación inducida por TGF-β1 en fibroblastos normales y reduce la capacidad proliferativa de los fibroblastos de IPF a través de la vía PI3K/Akt/mTOR. Además, la supresión de SPP1 en los fibroblastos de FPI dio como resultado una proliferación disminuida de células de NSCLC y una activación reducida de la vía PI3K/Akt/mTOR. Estos descubrimientos revelan el papel fundamental de SPP1 en la patogénesis de la FPI que coexiste con el NSCLC.
Materiales y métodos
Recolección de muestras de pacientes y muestras de tejido.
Recolectamos muestras de tejido pulmonar de pacientes con un diagnóstico confirmado de FPI durante una cirugía de trasplante de pulmón en el Hospital Popular de Wuxi. Los criterios de inclusión para seleccionar pacientes con FPI fueron los siguientes: Pacientes masculinos mayores de 50 años con diagnóstico por imágenes del tórax mediante tomografía computarizada de alta resolución (TCAR) que muestre patrones habituales de neumonía intersticial (NIU). Estos patrones se caracterizaron principalmente por anomalías reticulares predominantes subpleurales y basales y panal, con o sin bronquiectasias por tracción asociadas y opacidades mínimas en vidrio esmerilado. Además, se requirió confirmación histopatológica posoperatoria de NIU, incluida evidencia de fibrosis pulmonar en parches y focos visibles de proliferación de fibroblastos. Se excluyeron los pacientes con otras causas conocidas de enfermedad pulmonar intersticial (EPI), como exposición familiar u ocupacional, enfermedad del tejido conectivo o toxicidad farmacológica. A modo de comparación, obtuvimos tejidos pulmonares normales de dos fuentes: pulmones de donantes durante procedimientos de trasplante y regiones no tumorales de pulmones extirpados durante cirugías de cáncer de pulmón. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular de Wuxi (No. KY22060) y todos los participantes dieron su consentimiento informado.
Cultivo celular y aislamiento de fibroblastos primarios.
Las células A549 y las líneas celulares HFL1 (fibroblasto de pulmón fetal humano 1) se obtuvieron de iCell Bioscience en Shanghai. Aislamos fibroblastos primarios tanto de FPI como de tejidos pulmonares sanos. Estos tejidos se cortaron finamente en segmentos de 1 a 2 mm, se homogeneizaron y luego se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, EE. UU.), enriquecido con suero bovino fetal (FBS) al 10 % y una mezcla de antibióticos al 1 %. Después de la adhesión celular, eliminamos las células no adherentes. Las células HFL1 se cultivaron en medio F12K (Meilunbio, Dalian, China), fortificadas con 10% de FBS (Gibco), todo dentro de un ambiente mantenido a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
reactivos
El factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) se adquirió de Abcam (Reino Unido) y se conservó a -20 °C en un tampón de citrato 10 mM. El inhibidor de PI3K, LY294002, se adquirió de Sigma y se conservó de manera similar a -20 °C, pero en dimetilsulfóxido (DMSO). Bortezomib, obtenido de MedChemExpress (MCE, EE. UU.), también se almacenó a -20 °C, pero se disolvió en solución salina al 0,9 %.
Análisis cuantitativo por RT-PCR.
El ARN total se extrajo de muestras de tejido pulmonar y de fibroblastos utilizando el kit de aislamiento de ARN animal (Beyotime, China) y luego se transcribió de forma inversa en ADNc con PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japón). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 (ABI, EE. UU.) utilizando la mezcla maestra SYBR qPCR (Vazyme, Nanjing, China). En este proceso, GAPDH sirvió como gen de referencia y los datos se analizaron utilizando el método 2−△△Ct.
transferencia Western
Se preparó proteína total de tejidos pulmonares y fibroblastos utilizando un tampón de lisis. Luego, estas proteínas se separaron mediante electroforesis en gel y posteriormente se transfirieron a membranas. Después de bloquear estos…
