Resumen
Antecedentes
La vía de señalización TGF-β/SMAD es crucial en la patogénesis del asma. Sin embargo, el miembro de la familia SMAD 4 (SMAD4), un mediador clave de TGF-β, sus roles y mecanismos subyacentes en el asma siguen sin estar claros.
Métodos
Los roles in vivo e in vitro de Smad4 en el asma se investigaron a través de un modelo de ratón inducido por ovalbúmina (OVA) y un modelo de célula inducida por interleucina-13 (IL-13). El mecanismo molecular del asma influenciado por Smad4 se examinó mediante secuenciación del transcriptoma, seguido de experimentos de retroalimentación que involucran interleucina humana recombinante 17 A (Rhil-17 A), un activador de la vía de señalización IL-17 A.
Resultados
Smad4 se expresó altamente en los modelos de asma. Smad4 silenciamiento alivió el daño al tejido pulmonar y una disminución de la infiltración inflamatoria. Los niveles de expresión de la caspasa-3, la IgG y los factores inflamatorios se redujeron después del silenciamiento de Smad4. Silenciamiento Smad4 suprimió la ferroptosis. El silenciamiento de Smad4 también mejoró la proliferación de células BEAS-2B inducida por IL-13 y la apoptosis suprimida. Además. IL-17 Una vía de señalización se promovió en los modelos de asma, como lo demuestran los niveles elevados de proteínas IL-17RA, IL-17 A y ACT1. El silenciamiento Smad4 inhibió los niveles de expresión de estas proteínas asociadas a la vía IL-17 A. Además, RHIL-17 Un tratamiento revirtió notablemente los impactos del silenciamiento de Smad4 sobre el asma en el modelo celular inducido por IL-13 y el modelo de ratón inducido por OVA, lo que indica que el silenciamiento de Smad4 inhibió la inflamación y la ferroptosis en la asma al bloquear el IL-17 A Significando una señalización de la señalización A de IL-17 A A. camino.
Conclusión
Silenciar Smad4 previene la inflamación y la ferroptosis en el asma al inhibir la vía IL-17, que proporciona un nuevo enfoque potencial para la terapia con asma.
Introducción
El asma, un trastorno alérgico dependiente de las células Th2 y mediado por IgE, se caracteriza por la inflamación de las vías respiratorias, la hiperreactividad y la remodelación (1). Más de 300 millones de personas en todo el mundo sufren asma, con síntomas que incluyen sibilancias recurrentes, dificultad para respirar y opresión en el pecho. En casos severos, el asma puede conducir a la muerte, lo que representa una seria amenaza para la vida y el estatus socioeconómico global (2, 3). La genética y las exposiciones ambientales que afectan la respuesta inmune son los dos factores de riesgo principales para el asma severa (4). Los corticosteroides y los broncodilatadores son los medicamentos de primera línea para la intervención del asma, y la mayoría de los pacientes pueden controlar bien sus síntomas con estos medicamentos (5). Sin embargo, el asma es una enfermedad pulmonar heterogénea con múltiples fenotipos y endotipos únicos. Esta diversidad conduce a respuestas variables al tratamiento y aún se producen síntomas refractarios en pacientes con enfermedad grave (6). Por lo tanto, explorar la patogénesis del asma es crucial para desarrollar tratamientos personalizados y precisos.
Las proteínas SMAD son mediadores de señalización intracelular del factor de crecimiento transformador β (TGFβ) superfamily y juegan un papel importante en la respuesta inmune, la fibrosis y la tumorigénesis (7). Se informa que inhibir la vía de señalización TGF-β/SMAD puede aliviar el asma (8, 9) .Mad Family Miember 4 (Smad4), un elemento clave de la vía TGF-β, forma un complejo con SMADS activados por receptores y se transloca al núcleo, donde modula la transcripción de diferentes genes diana e impacta una variedad de procesos biológicos (10). Varios estudios anteriores han revelado que Smad4 juega un papel importante en el desarrollo tumoral (11, 12). Recientemente, la función de Smad4 en el asma ha atraído una atención creciente. Li et al. descubrió que la sobreexpresión de TRIM33 reduce la expresión de Smad4 e inhibe la activación de Wnt/β-catenina, que regula la inflamación del asma y la remodelación de las vías respiratorias (13). Wang et al. ha revelado que la tectorigenina es efectiva para prevenir la fibrosis pulmonar inducida por la ovalbúmina (OVA) y la inflamación de las vías respiratorias en los conejillos de indias modulando la vía de señalización TGF-β1/SMAD, que implicó una disminución en la expresión de Smad4 (14). Sin embargo, el papel específico y los mecanismos moleculares de Smad4 en el asma aún no están claros.
La ferroptosis, un tipo de muerte celular regulada recién descubierto, se define por la acumulación de hierro y la peroxidación lipídica (15). La ferroptosis está implicada en numerosos trastornos pulmonares, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la fibrosis quística y la apnea obstructiva del sueño (16). Además, los estudios crecientes indican que la ferroptosis tiene un papel fundamental en el desarrollo del asma (17, 18). El metabolismo del hierro, el metabolismo lipídico, la producción reactiva de especies de oxígeno (ROS) y el metabolismo de los aminoácidos son procesos biológicos asociados con la ferroptosis, y todos están relacionados con el asma (19). Los genes vinculados a la ferroptosis están implicados en el asma y manejan el microambiente inmunitario (20). Smad tiene una correlación importante con la ferroptosis. Se ha demostrado que la vía de señalización TGF-β-SMAD afecta la ferroptosis en las células cancerosas (21). AAV9-HGF combinado con un inhibidor de TGF-β/SMAD reduce la fibrosis de silicosis al suprimir la ferroptosis (22). Sin embargo, se desconoce si Smad4 influye en el desarrollo del asma al regular la ferroptosis.
La interleucina 17 (IL-17), también conocida como IL-17 A, es una citocina proinflamatoria producida por las células T Helper 17 (Th17). La señalización de IL-17 a través del complejo del receptor IL-17RA/IL-17RC desencadena la expresión de quimiocinas y citocinas (23, 24). IL-17 A contribuye al desarrollo de múltiples enfermedades inflamatorias crónicas como el asma (25). Los niveles aumentados de IL-17 se encuentran en muestras de biopsia pulmonar y esputo de pacientes asmáticos, correlacionándose con asma severa (26). Se informa que UBD está implicado en el asma neutrofílica al impulsar la activación de la cascada de señalización de IL-17 (27). Además, los esteroides antiinflamatorios como los glucocorticoides son el tratamiento preferido para el manejo de la inflamación de las vías respiratorias y son altamente efectivos para tratar el asma persistente; Sin embargo, la inflamación de las vías respiratorias mediada por células Th17 sigue siendo resistente a los esteroides, dejando un subconjunto de asmáticos que no responden a esta terapia (28). Por lo tanto, es vital examinar la interacción entre las vías de señalización SMAD4, ferroptosis y IL-17 para obtener una comprensión integral del papel potencial de la vía de señalización de IL-17 en el asma. Esta investigación buscó comprender el papel y las vías moleculares que involucran smad4 en el asma. El modelo de ratones inducido por OVA y el modelo de línea celular epitelial humana humana inducida por IL-13 (células BEAS-2B) se usan comúnmente para estudiar el asma (29,30,31). En este estudio, basado en el modelo de ratones inducido por OVA y el modelo de células BEAS-2B inducido por IL-13, encontramos que al bloquear la IL-17 una vía de señalización, silenciando la inflamación y la ferroptosis mitigada por Smad4 en el asma, ofreciendo un nuevo enfoque para tratar el asma.
Materiales y métodos
Tratamiento animal
Se compraron ratones BALB/C hembra (de 6 a 7 semanas de edad, 18-20 g) de SPF Biotechnology Co. (Beijing, China) y se mantuvieron en condiciones específicas de temperatura libre y controlada (24 ± 1 ° C). Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se suministraron con una dieta normal y agua potable. Después de una semana de carcasa, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (seis ratones en cada grupo): un grupo de tratamiento simulado (control), un grupo de modelo OVA (OVA), un modelo de OVA tratado con un grupo de control de ARN-Negative de ARN corto de horquilla corto (OVA + LV-SHNC), y un modelo OVA tratado con SH-SMAD4 (OVA + LV-SH SMAD4). Tres días antes del establecimiento del modelo OVA, se inyectaron 200 µl (2 × 107 Tu/ml) de SH-NC o SH-SMAD4 en la vena de la cola de ratones (32). Para la inducción del modelo de OVA, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 125 µl de suspensión de antígeno de OVA, que contenía 50 µl de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.), 5 µl 1% de OVA (Grado V; Sigma-Aldrich) , y 70 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS). En los días 8–21, los ratones se mantuvieron en recipientes sellados y luego se expusieron a 20 ml de OVA en aerosol al 5% (Grado II, Sigma-Aldrich) durante 30 minutos. En el grupo de control, los ratones fueron tratados con un volumen idéntico de PBS de la misma manera. Además de los síntomas relacionados con el asma, los ratones no tenían otras anormalidades. El día 22, los ratones fueron sacrificados por la inhalación de isoflurano. Se obtuvieron muestras de sangre de ratones del ventrículo derecho y luego el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) se recuperó inculcando solución salina estéril fría (600 µl cada vez/ tres veces). Después de la centrifugación de muestras de sangre y BALF a 3.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C, los sobrenadantes se cosecharon para mediciones posteriores. Se homogeneizó un total de 1 mg de tejido pulmonar en 5 ml de PBS helado usando un homogeneizador de vidrio, centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C, y el sobrenadante se obtuvo para un examen más detallado.
Tinción de hematoxilina -eosina (HE)
Después de ser fijado en paraformaldehído al 4%, los tejidos pulmonares se sometieron a deshidratación, se incrustaron en parafina y se seccionaron a un grosor de 5 μm. Las secciones se despejaron usando xileno y luego se rehidrataron por etanol anhidro I y II, 95, 90, 80 y 70% de etanol anhidro. Después de un enjuague con agua destilada, las secciones se sumergieron en Harris hematoxilina durante 5 minutos. A continuación, se diferenciaron usando ácido clorhídrico al 1% durante unos segundos, seguidos de un tratamiento de amoníaco para restaurar el color azul y contratados con eosina durante 3 minutos. Después de la hialinización, las secciones se sellaron con goma neutral, y las imágenes histológicas se obtuvieron usando un microscopio óptico (Olympus, Tokio, Japón).
Inmunohistoquímica
Las secciones embebidas en parafina se despojaron, se rehidrataron y se trataron con EDTA de 10 mmol/L para la reparación del antígeno. La peroxidasa endógena se inactivó incubando los rodajas con H2O2 al 0,3% a 37 ° C. Las secciones se bloquearon con suero de cabra normal durante 60 minutos y luego se incubaron con anticuerpo anti-Caspasa-3 (AB184787, 1: 1000, ABCAM, Cambridge, EE. UU.) Durante la noche a las 4 ℃. Luego, las secciones se trataron con un anticuerpo secundario (abcam) en la oscuridad a 37 ℃ durante 60 min. Después de realizar tres lavados con PBS, las secciones fueron manchadas …
(Tagstotranslate) Smad Family Miembro 4 (T) Astma (T) Ferroptosis (T) Interleucina-17a (T) Sistema de neumología/respiratoria
