Resumen
Antecedentes
La polarización de los macrófagos M2 juega un papel crítico en la inflamación de las vías respiratorias tipo 2 en el asma. Anteriormente informamos que el inhibidor de la serina peptidasa, Clade B, Miembro 10 (SERPINB10) promueve la inflamación eosinofílica de las vías respiratorias en el asma.
Objetivo
Investigar el papel de SERPINB10 en la polarización de los macrófagos M2 y la inflamación de las vías respiratorias en el asma.
Métodos
La expresión de SERPINB10 se detectó en células de lavado broncoalveolar (BAL) de 15 sujetos de control y 36 pacientes con asma. Los ratones knockout serpinb10 y los ratones de tipo salvaje se sensibilizaron y desafiaron con ovalbúmina (OVA). Se evaluaron la polarización de los macrófagos y la inflamación de las vías respiratorias. Se realizó un experimento de transferencia adoptiva de macrófagos deficientes en SERPINB10 a ratones agotados por macrófagos para evaluar el efecto de la deficiencia de SerpinB10 en los macrófagos en la inflamación de las vías respiratorias en el modelo. El papel de SERPINB10 en la activación de la vía de señalización del receptor IL-4 (IL-4R) y la polarización de los macrófagos M2 se investigaron en cultivos celulares.
Resultados
La expresión de SERPINB10 se elevó notablemente en células BAL de pacientes asmáticos, y se correlacionó significativamente con el óxido nítrico exhalado fraccional y CD206, un marcador para la polarización de los macrófagos M2. En el modelo de ratón de inflamación alérgica de las vías respiratorias alérgicas inducidas por OVA, la deficiencia de SerpinB10 inhibió significativamente la inflamación de las vías respiratorias, la metaplasia de células mucosas y la hiperreactividad de las vías respiratorias. Además, la deficiencia de SERPINB10 suprimió la expresión de marcadores M2, incluidos CD206, Arg1 en tejidos pulmonares de ratón y los niveles de proteína de citocinas efectoras de macrófagos M2, incluidos CCL17 y CCL22 en líquido BAL. La transferencia adoptiva de los macrófagos derivados de la médula ósea deficiente en SERPINB10 (BMDMS) a los macrófagos agotados de ratones de tipo salvaje suprimió significativamente la inflamación de las vías respiratorias y la metaplasia de células mucosas. Mecánicamente, SerpinB10 suprime la degradación de IL-4Rα en los macrófagos, regulando así la fosforilación de STAT6 y AKT y que conduce a la polarización de los macrófagos M2.
Conclusiones
SERPINB10 promueve la polarización de los macrófagos M2 al suprimir la degradación de IL-4Rα y regular la señalización de IL-4R. SERPINB10 es un objetivo terapéutico potencial para el asma.
Introducción
El asma es una enfermedad de las vías respiratorias inflamatorias crónicas, caracterizada por la inflamación de las vías respiratorias, la hipersecreción de moco y la hiperreactividad de las vías respiratorias, y afecta a más de 300 millones de personas en todo el mundo (1,2,3). El asma se ha asociado durante mucho tiempo con las respuestas inmunes tipo 2, en las que están involucradas una variedad de células, incluidos los macrófagos (4). Los macrófagos se activan clásicamente o se activan alternativamente, también se llaman polarización M1 o M2, respectivamente (5). Los macrófagos M2 contribuyen a la patogénesis del asma al promover la inflamación de las vías respiratorias tipo 2 (6).
Los alérgenos estimulan que las células dendríticas presentan antígeno a las células T y promueven la diferenciación de las células Th2. Citocinas Th2, incluida la polarización de los macrófagos M2 de la unidad IL-4, (7). Los macrófagos M2 expresan CCL17 y CCL22, que orquestan las respuestas inmunes dominantes de Th2 en el asma a través del reclutamiento mediado por CCR4 de linfocitos Th2 y eosinófilos a las vías respiratorias. Esta cascada exacerba características patológicas clave del asma, incluida la hiperreactividad de las vías respiratorias, la hipersecreción de moco e inflamación eosinofílica (7,8,9). Aunque los macrófagos M2 son cruciales en la inflamación del asma de las vías respiratorias tipo 2, el mecanismo subyacente a la activación del macrófagos M2 no se entiende completamente.
Los inhibidores de la serina proteasa (SERPIN) es una familia de proteínas que regula la actividad de una variedad de proteasa que incluye serina proteasa (10). Está involucrado en procesos biológicos como fagocitosis, apoptosis y migración celular. SERPINB2 se ha asociado durante mucho tiempo con enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, incluido el asma (11). SERPINB2 se ha implicado en la polarización de los macrófagos M2 en el cáncer de mama e infección entérica (12, 13). También se informa que SERPINB2 regula la respuesta inmune en la lesión renal mediante la regulación de la fagocitosis y la migración de macrófagos (14). Nuestro estudio anterior reveló que la expresión de SerpinB10 aumentó en las muestras de cepillado bronquial y podría servir como un marcador potencial de la inflamación eosinofílica de las vías respiratorias en pacientes con asma. Deficiencia de serpinb10 suprimió la eosinofilia de la vía aérea en un modelo de ratón (15). Sin embargo, si SERPINB10 se expresa en los macrófagos y su papel en la polarización de los macrófagos M2 no está claro. Presumimos que SERPINB10 está involucrado en la inflamación alérgica de las vías respiratorias mediante la promoción de la polarización de los macrófagos M2 en el asma.
En este estudio, demostramos que la expresión de SerpinB10 se elevó en las células BAL de pacientes con asma y se correlacionó positivamente con la expresión de Feno y CD206. La deficiencia de SERPINB10 atenuó la inflamación y expresión de las vías respiratorias inducidas por OVA de CD206, Arg1 en tejidos pulmonares de ratón y los niveles de proteína de CCL17, CCL22 en BALF. La transferencia adoptiva de macrófagos deficientes en SERPINB10 a ratones de tipo salvaje agotado por macrófagos suprimió la inflamación pulmonar y la producción de moco. Mecánicamente, SERPINB10 promueve la polarización de los macrófagos M2 al suprimir la degradación de IL-4R.
Materiales y métodos
Sujetos
Treinta y seis pacientes con asma y 15 sujetos de control sano fueron reclutados del Hospital Tongji. Ninguno de los sujetos tenía un historial de fumar ni recibió terapia con corticosteroides. El análisis de datos clínicos de los sujetos se muestra en la Tabla S1. La broncoscopia se realizó como se describió anteriormente (16). Todos los sujetos habían firmado el consentimiento informado por escrito. El estudio obtuvo la aprobación del Comité de Ética del Hospital Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (TJ-IRB20231161).
Modelo murino de inflamación alérgica de las vías respiratorias
Los ratones SERPINB10 -/ – y ratones de tipo salvaje (WT) se compraron del Centro Animal de la Provincia de Hubei (Wuhan, China). En los días 0, 7 y 14, los ratones se sometieron a sensibilización a través de la inyección intraperitoneal de 100 μg de OVA (Sigma -Aldrich, EE. UU.) En 100 μl de solución salina mezclada con Al (OH) 3 o un volumen equivalente de solución salina intraperitoneal. En los días 21, 22 y 23, los ratones fueron desafiados por vía intranasal con la solución OVA (1 mg en 50 μl de solución salina). 24 h Después del desafío final, se midió la resistencia pulmonar y se realizaron recuentos de células BAL (17). Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Tongji (TJH-202309026).
Agotamiento de macrófagos y transferencia adoptiva
Los experimentos de transferencia adoptiva es el trasplante de células inmunes modificadas por ex vivo (p. Ej., Células T o macrófagos) en ratones receptores para evaluar su función en los modelos de enfermedades (18). Para agotar los macrófagos de pulmón de ratón, inyectamos liposomas de clodronato (200 μl) en los pulmones de los ratones SERPINB10 -/ – y WT en los días 18 y 19 ((17). SERPINB10-/-y WT BMDMS se trataron con 20 ng/ml de IL-4 durante 48 h. El día 20, los macrófagos mencionados se administraron en los pulmones de los ratones SERPINB10 -/ – y WT pretratados con liposomas de clodronato a una dosis de 1 × 106 células/50 μl por ratón.
Evaluación de la inflamación de las vías respiratorias y la secreción de moco
La intensidad de la inflamación peribronquial y la densidad de las células PAS positivas en la vía aérea de las secciones pulmonares de ratón se puntuaron como se describió previamente utilizando la tinción HE y la tinción con PAS, respectivamente ((16, 19).
Cultivo celular y tratamiento
Las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de FBS (industrias biológicas, Israel) y estimuladas por PMA. Luego, las células THP-1 se transfectaron con NC siRNA o siRNA SerpinB10 que utiliza lipofectamina 3000 (Invitrogen, CA). 48h antes de la cosecha celular para qPCR y transferencia Western, IL-4 (20 ng/ml, peprotech) se agregó.
Cultivo y tratamiento de los macrófagos primarios
Los BMDM se derivaron de ratones SERPINB10-/-y WT y se cultivaron con M-CSF. Después de 7 días, los BMDM se trataron con 20 ng/ml de IL-4. Los macrófagos pulmonares primarios se derivaron de los ratones SERPINB10 -/ – y WT. Usando la colagenasa I estéril, el tejido pulmonar de los ratones se convirtió en suspensión de una sola célula. Luego, las células se trataron con 20 ng/ml de IL-4.
ELISA
Según las instrucciones del fabricante, la concentración de CCL17 y CCL22 en el BALF se determinó utilizando kits ELISA.
Tinción de inmunofluorescencia
La tinción de inmunofluorescencia de BMDMS se realizó siguiendo el protocolo del kit de herramientas universal IF (Abbkine, Wuhan, China). Brevemente, los portaobjetos de células BMDM se fijaron en paraformaldehído al 4% y se incubaron con tampón de permeabilización de inmunotinción y luego con tampón de bloqueo de suero de cabra a 25 ℃. Las células se incubaron luego con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Las células se lavaron con tampón de lavado de anticuerpos y se incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes durante 1 h en la oscuridad. Posteriormente, DAPI se volvió a ganar durante 15 minutos y los portaobjetos se montaron con un medio de montaje antifade mejorado Superkine ™.
Transferencia Western
Se usó tampón RIPA para extraer proteínas. La transferencia Western de las proteínas se realizó con los anticuerpos especificados. El software Image J se utilizó para evaluar la densitometría.
RT-PCR cuantitativo
El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol. Se usó un kit de transcriptasa inversa para adquirir ADNc. SYBR premix ex taq se utilizó para RT-PCR cuantitativa. Todos los reactivos anteriores se adquirieron en Takara (Tokio, Japón). Los cebadores se enumeran en la Tabla S2.
Análisis estadístico
Los datos distribuidos normalmente se presentan como medias ± DE, y se utilizaron análisis de pruebas paramétricas. En casos de distribución no normal, se calculan los valores medios y sus rangos intercuartiles, y se aplican enfoques estadísticos no paramétricos. Para evaluar las correlaciones, se utiliza el coeficiente de correlación de rango de Spearman. El análisis estadístico se llevó a cabo con GraphPad Prism versión 9.5 (Software GraphPad, EE. UU.). La significación estadística se establece en P <0.05.
Resultados
La expresión de SERPINB10 aumenta y se correlaciona con la expresión de CD206 en células BAL de pacientes con asma
Las características de los sujetos se resumieron en la Tabla S1. No había …
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