Resumen
Antecedentes
El proteoma circulante puede proporcionar información sobre la patobiología de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y biomarcadores de diagnóstico o pronóstico. Aplicamos cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas para cuantificar el proteoma de sangre periférica en pacientes con FPI e identificar proteínas asociadas con la gravedad y la progresión de la enfermedad.
Métodos
La cohorte de FPI estuvo compuesta por 299 pacientes del Registro IPF-PRO. Los controles (n = 99) sin enfermedad pulmonar conocida tenían distribuciones similares de edad, sexo y tabaquismo a la cohorte de FPI. Las proteínas se midieron en el plasma recolectado en el momento de la inscripción utilizando un Evosep One acoplado a un Orbitrap Exploris. Los datos se analizaron con Spectronaut 14 con una biblioteca espectral experimental profunda y se transformaron log2. Se utilizó la regresión lineal para comparar la abundancia de proteínas en la cohorte de FPI versus la de control e identificar proteínas asociadas con medidas de gravedad de la enfermedad en el momento de la inscripción en la cohorte de FPI. Se utilizaron análisis de regresión de Cox para identificar proteínas asociadas con los resultados en la cohorte de FPI, dividida 75/25 en conjuntos de entrenamiento y prueba. La tasa de descubrimiento falso se controló al 5%.
Resultados
En total, se detectaron 761 grupos de proteínas correspondientes a 736 genes únicos. De estos, 168 grupos de proteínas fueron significativamente diferentes en abundancia en las cohortes de FPI versus control, de los cuales 39 fueron ≥ 1,3 veces diferentes. Entre las principales proteínas expresadas diferencialmente se encuentran la proteína surfactante B (SFTPB), el miembro 1 de la familia secretoglobina 3A, la molécula de adhesión intercelular 1, la trombospondina 1 y el factor plaquetario 4. En pacientes con FPI, una mayor abundancia de apolipoproteína A-1 se asoció estadísticamente de manera significativa con un mayor porcentaje de capacidad vital forzada previsto en el momento de la inscripción, mientras que una mayor abundancia de fibulina-1 se asoció estadísticamente de manera significativa con una menor capacidad de difusión de los pulmones para el porcentaje de monóxido de carbono previsto. Los modelos multivariables seleccionaron 4 proteínas (SERPINA7, SFTPB, glicoproteína alfa 2 HS, cininógeno 1) y 3 factores clínicos que mejor discriminaban el riesgo de muerte respiratoria o trasplante de pulmón en pacientes con FPI, con un índice C de 0,78 en el conjunto de entrenamiento y 0,72 en el conjunto de prueba.
Conclusiones
El análisis proteómico basado en espectrometría de masas de los datos del Registro IPF-PRO confirmó proteínas previamente asociadas con la presencia, gravedad y progresión de la FPI y reveló nuevos biomarcadores candidatos.
Registro de prueba
ClinicalTrials.gov; Nº: NCT01915511; registrado el 5 de agosto de 2013; URL: www.clinicaltrials.gov.
Fondo
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar fibrótica progresiva asociada con una alta mortalidad (1). A pesar de los avances en las pruebas radiológicas y serológicas, sigue siendo una enfermedad con importantes desafíos de diagnóstico y pronóstico.2, 3). Los pacientes con FPI muestran trayectorias de enfermedad heterogéneas (4, 5). El desarrollo de biomarcadores para ayudar en la evaluación del pronóstico sigue siendo una necesidad insatisfecha. Varios biomarcadores de proteínas circulantes se han mostrado prometedores como predictores de la progresión de la enfermedad o la mortalidad (6,7,8,9,10), pero ninguno es lo suficientemente preciso como para justificar su uso en la práctica clínica.
La cuantificación del proteoma circulante en pacientes con FPI puede proporcionar información sobre la patobiología de esta enfermedad y descubrir biomarcadores candidatos para diagnóstico o pronóstico. Los análisis proteómicos en FPI generalmente han empleado enfoques que se limitan a cebadores objetivo, como tecnologías basadas en aptámeros o ensayos de extensión de proximidad (8, 10, 11), que no cuantifican directamente proteínas ni permiten el descubrimiento de biomarcadores más allá de una lista predefinida de objetivos. La proteómica basada en espectrometría de masas representa una metodología ortogonal y complementaria que ofrece distintas ventajas, específicamente la detección imparcial de abundantes proteínas asociadas a enfermedades que no están cubiertas en paneles específicos. En este estudio, aplicamos cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas (MS) para cuantificar el proteoma de sangre periférica en pacientes con FPI y controles de distribución similar por edad y sexo. Además, en la cohorte de FPI, identificamos proteínas asociadas con la gravedad y la progresión de la enfermedad durante el seguimiento.
Métodos
Cohortes
La cohorte de FPI estuvo compuesta por pacientes inscritos en el Registro de resultados prospectivos de fibrosis pulmonar idiopática (IPF-PRO) (ClinicalTrials.gov; No: NCT01915511; registrado el 5 de agosto de 2013) en sitios de EE. UU. entre junio de 2014 y febrero de 2017 (12). Los pacientes tenían FPI diagnosticada o confirmada en el centro de inscripción en los últimos seis meses, según las directrices de diagnóstico internacionales de 2011 (13). En el momento de la inscripción se recogieron una muestra de sangre y datos demográficos/clínicos. Después de la inscripción, los datos clínicos se recopilaron como parte de la atención de rutina de los pacientes hasta la muerte, el trasplante de pulmón o la retirada del registro. Los resultados se determinaron desde la inscripción hasta marzo de 2023. El investigador informó que las muertes se debían a una causa respiratoria o no. Los pacientes en este análisis tenían una muestra de sangre de inscripción que pasó las medidas de control de calidad para la proteómica.
La cohorte de control se extrajo del Registro Comunitario y Biorrepositorio del Estudio de Medición para Comprender la Reclasificación de la Enfermedad de Cabarrus/Kannapolis (MURDOCK), un estudio de cohorte longitudinal de adultos en Carolina del Norte (NCT0170840) (14). Los participantes eran blancos; no hispano; entre 60 y 80 años; no había reportado ninguna enfermedad respiratoria, cáncer o enfermedad autoinmune; no fumó ni estuvo expuesto al tabaco de segunda mano; no utilizó medicamentos dirigidos a las vías respiratorias ni inmunomoduladores. Se utilizó un muestreo aleatorio, estratificado por edad, sexo y tabaquismo (nunca/nunca), para seleccionar 100 controles con una distribución similar de estas características a la cohorte de FPI.
Preparación de muestras
Las muestras de plasma de las dos cohortes se procesaron juntas y las muestras se aleatorizaron por paciente para mitigar los efectos del lote. Se analizaron muestras de referencia comerciales en paralelo para evaluar el rendimiento del flujo de trabajo. Las muestras se procesaron con una plataforma automatizada de manipulación de líquidos (Agilent Bravo). Las muestras de plasma no estaban inmunodeprimidas antes de la detección y cuantificación de la proteína MS. Sin embargo, para aumentar la cobertura de proteínas y mejorar la identificación de péptidos durante el procesamiento de datos posteriores, se generó una biblioteca espectral experimental profunda a partir de 100 muestras aleatorias de FPI y de control que se combinaron y se agotaron de las siete proteínas plasmáticas más abundantes (albúmina, inmunoglobulina A, inmunoglobulina G, transferrina, haptoglobina, antitripsina y fibrinógeno). Luego las proteínas se redujeron, alquilaron y digirieron. Se crearon dos bibliotecas espectrales experimentales adicionales a partir de conjuntos de péptidos tomados de muestras digeridas, que contenían exclusivamente IPF o exclusivamente muestras de control. Los grupos de péptidos se fraccionaron. Los detalles se proporcionan en el archivo adicional 1, sección S1.
LC-MS/MS
Los péptidos se analizaron mediante un Evosep One (Evosep) LC (15) acoplado a un Exploris Orbitrap 480 MS (Thermo Scientific) mediante una fuente de iones de pulverización de nanoelectrones (16). La identificación de péptidos y la comparación espectral de archivos sin procesar de MS dependientes de datos de las muestras de la biblioteca espectral experimental se realizaron con la plataforma de proteómica computacional MaxQuant (17) versión 1.6.14. La inferencia de proteínas se realizó utilizando el proteoma de referencia Uniprot. Se generó una biblioteca espectral experimental a partir de los archivos de salida de MaxQuant y los archivos sin procesar de MS correspondientes utilizando Spectronaut (Biognosis) versión 14. La identificación y cuantificación de proteínas a partir de archivos sin procesar de MS independientes de los datos de las muestras de cohorte se realizaron con Spectronaut. La coincidencia espectral y la identificación de péptidos se realizaron utilizando la biblioteca espectral experimental profunda, que mejoró tanto la profundidad como la cobertura (consulte el archivo adicional 1: Fig. S1). La cuantificación sin etiquetas se realizó con QUANT 2.0. Los resultados se transformaron log2 y los valores faltantes se imputaron mediante imputación de reducción de marcha (18). La corrección por lotes se realizó utilizando pyComBat. El análisis de componentes principales (PCA) después de la corrección por lotes mostró una buena agrupación de las muestras de referencia (consulte el archivo adicional 1: Fig. S2). Los detalles se proporcionan en el archivo adicional 1, sección S1.
Análisis estadísticos
Se utilizó la regresión lineal para comparar la abundancia de proteínas (variable dependiente) en las cohortes de FPI frente a las de control (variable independiente). Se realizaron comparaciones entre grupos de tratamiento antifibrótico específicos (nintedanib, pirfenidona, ningún tratamiento) y controles para determinar si las diferencias en la abundancia de proteínas entre los controles y los pacientes con FPI variaban según el uso de fármacos antifibróticos. Además, entre los pacientes con FPI, se compararon las concentraciones de proteínas entre subconjuntos según el uso de fármacos antifibróticos (nintedanib versus ningún tratamiento, pirfenidona versus ningún tratamiento, nintedanib versus pirfenidona). Los valores de p se corrigieron para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg para controlar la tasa de descubrimiento falso (FDR) al 5%. Las proteínas se consideraron significativamente diferentes en abundancia entre los grupos si p corregido por FDR ≤ 0,05. Se detectaron vías enriquecidas en las cohortes de FPI versus control realizando un análisis de sobrerrepresentación a nivel genético con clusterProfiler (19). Las vías canónicas establecidas desde Reactome (20) se utilizó como conjunto de referencia. El conjunto de antecedentes estaba definido por todos los genes correspondientes a todos los grupos de proteínas detectados. Las vías con p <0,01 corregido por FDR se consideraron significativamente enriquecidas.
Entre los pacientes con FPI, se utilizó la regresión lineal para determinar las proteínas asociadas con las medidas de gravedad de la enfermedad en el momento de la inscripción (% previsto de capacidad vital forzada (FVC) y capacidad de difusión de los pulmones para monóxido de carbono (DLCO) % previsto). En estos modelos, la concentración de proteínas se consideró la variable independiente y la medida de la gravedad de la enfermedad la variable dependiente. Se consideró que las proteínas estaban asociadas estadísticamente de manera significativa con una medida de gravedad de la enfermedad si p ≤ 0,05 corregido por FDR y clínicamente significativamente…
