Resumen
Antecedentes
Muchos virus respiratorios atacan el epitelio de las vías respiratorias y causan un amplio espectro de enfermedades para las cuales tenemos terapias limitadas. Hasta la fecha, se han informado algunos modelos primarios basados en células madre humanas de la vía aérea proximal para el descubrimiento de fármacos, pero ampliarlos a una plataforma de mayor rendimiento sigue siendo un desafío significativo. Como resultado, la mayoría de los ensayos de detección de fármacos para virus respiratorios se realizan en cultivos 2D basados en línea de células comerciales que proporcionan una capacidad de traslación limitada.
Métodos
Optimizamos un modelo primario de epitelio de epitelio de la vía aérea mucociliar de células madre humanas de la infección SARS-CoV-2, en formato de interfaz de aire-líquido (ALI) de 96 pocillos, que es susceptible de detección de fármacos de rendimiento moderado. Probamos el modelo contra la tensión parental SARS-CoV-2 (Wuhan) y las variantes beta, delta y omicron. Aplicamos este modelo para detectar 2100 compuestos de bibliotecas de medicamentos específicos utilizando un método de cuantificación basado en imágenes de alto contenido de alto rendimiento.
Resultados
El modelo recapituló la heterogeneidad de la infección entre pacientes con cepa y variantes parentales SARS-CoV-2. Si bien hubo respuestas heterogéneas entre las variantes para los compuestos del factor de huéspedes, los dos antivirales de acción directa que probamos, remdesivir y paxlovid mostraron una eficacia constante para reducir la infección en todas las variantes y donantes. Usando el modelo, caracterizamos un nuevo fármaco antiviral efectivo tanto contra la cepa parental como en la variante omicrona.
Conclusión
Este estudio demuestra que el modelo ALI de 96 pocillos del epitelio mucociliar humano primario puede recapitular la heterogeneidad de la infección entre diferentes donantes y variantes SARS-CoV-2 y puede usarse para el detección moderada de rendimiento. Compuestos que los factores objetivo del huésped mostraron variabilidad entre los pacientes en respuesta a SARS-CoV-2, mientras que los antivirales de acción directa fueron efectivos contra SARS-CoV-2 a pesar de la heterogeneidad de los pacientes evaluados.
Fondo
La pandemia severa del Virus Corona 2 (SARS-CoV-2) del síndrome agudo ha resultado en más de 7 millones de muertes en todo el mundo a partir de junio de 2024 (1). Estimuló un esfuerzo global para desarrollar nuevos medicamentos y terapias para combatir el virus. Los anticuerpos y vacunas monoclonales se desarrollaron rápidamente dentro de un año del inicio de la pandemia. Sin embargo, todavía existe una búsqueda continua de mejores moléculas pequeñas para cepas SARS-CoV-2 actuales y en evolución con menos efectos secundarios e interacciones fármacos, especialmente para pacientes inmunocomprometidos y no vacunados. La investigación continua se ha centrado en comprender y modular ambos factores del host (2,3,4,5) y factores virales (6,7,8) influir en la gravedad de Covid-19.
La detección de medicamentos de alto rendimiento (HTS) de las bibliotecas de medicamentos reutilizadas aprobadas por la FDA es una estrategia preferida para el descubrimiento de fármacos debido al perfil de seguridad conocido de los compuestos, la rentabilidad y la eficiencia del tiempo (9, 10). Ha habido muchos esfuerzos de detección de drogas desde el inicio de la pandemia Covid-19, utilizando ambos computacionales (11,12,13,14) y métodos in vitro. Las pantallas tradicionales de alto rendimiento in vitro (HTS) para infecciones virales respiratorias a menudo se realizan en cultivos 2D de líneas celulares comerciales como Vero E6, Huh7, Huh7.5, Caco2, Calu-3, A549 y varias otras líneas celulares no humanas. Estas proyecciones de medicamentos basadas en la línea celular carecen de los tipos de células epiteliales de las vías respiratorias mucociliares humanas altamente especializadas y la respuesta inmune innata del epitelio.
Los cultivos de interfaz de aire-líquido (ALI) son modelos bien establecidos que imitan las condiciones microfisiológicas del epitelio mucociliar funcional y también pueden usarse para estudiar la patogénesis de la enfermedad (15,16,17). Los cultivos de Ali pueden superar las limitaciones de los cultivos tradicionales basados en la línea de células 2D, ya que demuestran diferenciación a los tipos de células relevantes, la función de barrera epitelial y una respuesta inmune innata. El modelo de cultivo ALI ha demostrado los mecanismos de la infección SARS-CoV-2 de las células de la vía aérea, el papel de las exposiciones (por ejemplo, el tabaquismo) en la gravedad de la infección y las pruebas de drogas de bajo rendimiento (18,19,20,21,22,23). A pesar de que los cultivos Ali tienen un gran potencial para estudiar la eficacia de los medicamentos para las infecciones virales respiratorias que amplían el modelo ALI a una plataforma de detección de medicamentos robusta y de alto rendimiento sigue siendo un desafío debido a la complejidad de este modelo de cultivo (15,16,17,18,19, 22, 23). Recientemente, ha habido un creciente interés en desarrollar culturas Ali de mayor rendimiento (24,25,26). Aún así, no existen informes sobre la optimización de los sistemas ALI de alto rendimiento basado en células primarias humanas como una plataforma de detección de fármacos para la infección SARS-CoV-2. Además, no ha habido estudios para examinar la heterogeneidad entre los donantes de células madre de las vías respiratorias humanas en su respuesta a la infección SARS-CoV-2 en cultivos Ali, y no hay información sobre el modelado de la gravedad de la infección entre las variantes SARS-CoV-2.
Por lo tanto, desarrollamos una plataforma de cultivo Ali Mucociliares Mucociliares Humanas de 96 transswell con infección primaria SARS-CoV-2 y desarrollamos un nuevo método de cuantificación basado en imágenes para cuantificar esta infección. Utilizamos células madre basales de vías respiratorias humanas primarias de ocho pacientes sin antecedentes previos de enfermedad pulmonar, la cepa SARS-CoV-2 parental (Wuhan) y tres variantes SARS-CoV-2 (beta, delta y omicron) y tres bibliotecas de drogas para detectar 2100 solteras reutilizadas. Notamos una heterogeneidad significativa de la infección basada en donantes y variantes SARS-CoV-2. También encontramos una falta de consistencia en la eficacia de los medicamentos dirigidos a los factores del huésped. Sin embargo, al detectar con antivirales de acción directa, encontramos resultados consistentes en todas las variantes de donantes y SARS-CoV-2. Utilizamos nuestra plataforma Ali 96-Transwell para caracterizar una nueva molécula pequeña con propiedades antivirales y validamos su eficacia contra la tensión parental y la variante Omicron. Esta plataforma de cultivo ALI epitelial humana primaria de 96 transwell Human con infección SARS-CoV-2 muestra potencial para la detección de fármacos para infecciones virales respiratorias.
Métodos
Adquisición de tejidos humanos
Se adquirieron grandes vías respiratorias y tejidos bronquiales de tres fuentes de tejido diferentes: 1. donantes humanos normales no identificados después de los trasplantes de pulmón en el Centro Médico Ronald Reagan UCLA. Los tejidos se obtuvieron bajo un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional en la Facultad de Medicina David Geffen en UCLA (IRB#21-000390-CR-00003). 2. Las células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) de los no fumadores se obtuvieron de Lonza y todas las muestras se desidentificaron. 3. La información del paciente no identificada para todas las muestras se muestra en la tabla 1.
Tabla 1 Lista de demografía de donantes, bibliotecas de drogas probadas y variantes SARS-Cov-2Mesa de tamaño completo
Aislamiento absc
Las abscas humanas se aislaron utilizando el método publicado previamente de nuestro laboratorio (19, 27,28,29). Todos los pasos se realizaron con la tráquea en PBS frío con antimicrobianos. Las vías respiratorias cartilaginosas proximales se diseccionaron, limpiaron y se incubaron en 50 U/ml de dispase durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los tejidos se incubaron luego en 0,5 mg/ml de DNasa durante otros 45 minutos a temperatura ambiente. El epitelio se eliminó y se raspó con un raspador celular y se incubó en tripsina-EDTA al 0,25% durante 30 minutos, temblando a 37 ° C para generar una suspensión de una sola celda. Las células aisladas se pasaron a través de una serie de coladores, 500 μM, 300 μm y 100 μM de coladores, y se plataron directamente (paso 0 (P0)) para cultivos de interfaz de líquido de aire (ALI) o expandido.
Para la expansión, las ABSC aisladas se sembraron en matraces T75 precubiertos de colágeno IV de 0,5 mg/ml en una densidad de siembra de 1 × 106 hasta que alcanzaron el 80-90% de confluencia. Luego, las células se disociaron del matraz con estreadasa accesasa (Thermofisher Scientific), se centrifugaron a 300 × g durante 5 minutos, y se recogió el sedimento celular. Después de disolverse en 1 ml de medios de expansión y contar, las células se dividieron en una relación 1: 3–1: 5 y se volvieron a sembrar en matraces previos. Este proceso se repitió hasta el pasaje 2 (P2) y luego se colocó en placas de culturas ali.
96-tw Ali Cultures
96-V con insertos de membrana de poliéster de poro de 0,4 μm (Corning 7369) se recubrieron con 0,5 mg/ml de colágeno tipo IV y se dejaron secar al aire durante la noche dentro de un gabinete de bioseguridad. Las abscas (P0-P2) se sembraron a 8000–10,000 células por pozo en transwells recubiertos de colágeno en medio de neumacult ™ -Ex más medio (tecnologías de veloz), suplementado con primocina (invivogen), 1x penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN) antibiótica (Thermo Fisherg Scientific Scientific. Se permitió que las abscas crecieran en la fase sumergida con 180 μl de medios en la cámara basal y 75 μl de medios en la cámara apical hasta que estuvieron 80-100% confluentes y se formaron uniones de células apretadas (5-7 días). Los cultivos de Ali se establecieron luego a través del avión, y las células se cultivaron con 180 μl de medio Pneumacult ™ -Ali (tecnologías STEMCell) solo en la cámara basal durante 21 días hasta la infección viral. Los medios se cambiaron cada dos días, y los cultivos se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO2. En el caso de las pruebas de drogas, se agregaron medicamentos a su concentración requerida en los medios de cámara basales 24 h antes de la infección viral.
Infección sars-cov-2
SARS-CoV-2 strains including Isolate USA-WA1/2020 (Parental, BEI Resources NR-52281) at a low MOI (0.1), followed by the Isolate hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021 (Beta, BEI Resources NR-55282), Isolate hCoV-19/USA/MD-HP05647/2021 (Delta, BEI Resources NR-55672), y aislado HCOV-19/EE. UU./MD-HP20874/2021 (Omicron, BEI Resources NR-56461) se obtuvieron de los recursos infecciosos (bei) del Instituto Nacional de Alergias e Infecciosas (NIAID). Todas las cepas propagadas utilizadas en este estudio son verificadas por la secuencia. Todos los estudios que involucran virus vivos se realizaron en el …
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