Resumen
Antecedentes
La hipertensión pulmonar (pH) es una enfermedad vascular maligna caracterizada por la remodelación arterial pulmonar. La molécula de adhesión celular neural 1 (NCAM1) es una glucoproteína de la superficie celular que está involucrada en una variedad de enfermedades, incluida la enfermedad cardiovascular. Sin embargo, el papel de NCAM1 en el pH permanece subexplorado.
Métodos
Los modelos de hipertensión pulmonar se establecieron utilizando monocrotalina en ratas e hipoxia en ratones. Los niveles de proteína NCAM1 en plasma de pacientes y ratas se midieron por ELISA. La expresión de NCAM1 en tejidos pulmonares de rata se evaluó utilizando qRT-PCR, transferencia Western e inmunofluorescencia. Los efectos de NCAM1 en las células del músculo liso de la arteria pulmonar de la rata se estudiaron estimulando estas células con PDGF-BB.
Resultados
Se observaron niveles elevados de proteína NCAM1 y ARNm en pacientes con pH y ratas PH inducidas por monocrotalina. La eliminación de NCAM1 mejoró el pH inducido por hipoxia, destacando su papel en la remodelación de la arteria pulmonar. En PASMCS, la expresión de NCAM1 se reguló al alza por la estimulación con PDGF-BB, mejorando la proliferación y la migración celular. Este efecto fue atenuado por la eliminación de NCAM1 pero parcialmente restaurado por un activador de la vía ERK1/2 (TERT-Butilhidroquinona, TBHQ), lo que sugiere la participación de NCAM1 en la dinámica PASMC a través de la vía de señalización ERK1/2.
Conclusión
Nuestros hallazgos confirman el papel de NCAM1 en la hipertensión arterial pulmonar y demuestran su promoción de la proliferación y migración de PASMC a través de la vía de señalización ERK1/2.
Introducción
La hipertensión pulmonar (pH) se define como una presión arterial pulmonar media (MPAP) de> 20 mmHg, presión media de cuña de la arteria pulmonar (PAWP) de ≤15 mmHg y resistencia vascular pulmonar (PVR) de ≥2 unidades de madera. El pH se caracteriza por un aumento progresivo en la presión arterial pulmonar que eventualmente conduce a una hipertrofia cardíaca derecha grave e incluso a la muerte por insuficiencia cardíaca derecha (1). La remodelación vascular se considera la fisiopatología central en la fisiopatología multifactorial y compleja del pH (2). La proliferación, migración y resistencia a la apoptosis de las células del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC) juegan un papel clave en la remodelación vascular pulmonar (3). En la actualidad, el mecanismo fisiopatológico del pH todavía no se aclara completamente, y la proliferación maligna de PASMC aún no puede bloquearse por completo con las terapias objetivo actuales para el pH. Por lo tanto, el mecanismo de pH necesita una exploración adicional y nuevos objetivos terapéuticos potenciales encontrados para la reversión de la remodelación vascular pulmonar.
Se informa que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) está involucrado en el proceso patológico de hipertensión pulmonar. El aumento de la actividad de PDGF puede conducir a proliferación y migración de PASMC sin restricciones (4, 5). Se ha informado que PDGF-BB puede activar múltiples vías de transducción de señales que pueden regular la proliferación y migración de PASMCS (6,7,8). La remodelación vascular pulmonar se mitigó inhibiendo la vía de señalización PDGF-BB/PDGFR (9). La vía de señalización PDGF-BB/PDGFR conduce a la dimerización del receptor, la autofosforilación y luego la transducción de señales principalmente a través de la cascada de la quinasa de la proteína quinasa/extracelular regulada por mitógeno (MAPK/ERK), lo que conduce a la transcripción de genes dirigidos que promueven la proliferación de células y la migración de la migración y la migración de células y la migración (7, 10). Por lo tanto, la prevención y el tratamiento del pH se pueden lograr inhibiendo la proliferación anormal y la migración de PASMC que inducen por PDGF-BB.
La molécula de adhesión de células neurales 1 (NCAM1, también conocida como NCAM, CD56) es una glucoproteína de la superficie celular que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulina (IG) (11, 12). Se informa que NCAM1 es una molécula del receptor de transducción de señales capaz de regular una variedad de fenómenos biológicos, incluida la adhesión celular, la proliferación, la migración, la diferenciación, la supervivencia y la plasticidad sináptica (13). Los estudios han informado que NCAM1 regula la proliferación y migración de células de melanoma humano, que se logra a través de la regulación de la vía de señalización SRC/AKT/MTOR/cofilina (14). NCAM1 está involucrado en la aparición y el desarrollo de una variedad de enfermedades tumorales y no tumorales, incluido el carcinoma quístico adenoides salivales (15), ameloblastoma (16), Cáncer de tiroides (17) y enfermedades ateroscleróticas coronarias (18). Actualmente, más y más estudios han demostrado que hay muchas similitudes entre la patogénesis de la hipertensión pulmonar y los tumores, como la proliferación de células anormales (19) y el efecto de Warburg (20). La vía Ras-MAPK/ERK y los niveles de fosforilación de CREB en las células neuronales pueden aumentarse mediante la estimulación de NCAM1 (21). Sin embargo, si NCAM1 está involucrado en el desarrollo de la hipertensión pulmonar sigue siendo desconocido. Este estudio tuvo como objetivo investigar el papel NCAM1 en el pH y explorar el mecanismo potencial.
En el presente estudio, demostramos que NCAM1 promueve el desarrollo de la hipertensión pulmonar. Los experimentos in vitro indican que NCAM1 puede aumentar la proliferación y la migración de las células del músculo liso arterial pulmonar a través de la vía de señalización ERK1/2, participando así en la remodelación vascular pulmonar en la hipertensión pulmonar.
Materiales y métodos
Población de estudio
El estudio clínico fue aprobado por el comité de ética del primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Chongqing (2023-154). Todos los participantes firmaron el consentimiento informado. Se incluyeron un total de 39 sujetos, incluidos 21 controles sanos y 18 pacientes con hipertensión pulmonar idiopática. El pH se diagnosticó de acuerdo con los siguientes criterios: MPAP ≥ 25 mmHg, PAWP ≤ 15 mmHg y PVR ≥ 3 unidades de madera medidas en reposo y al nivel del mar por cateterismo cardíaco derecho (RHC). Se recolectaron muestras clínicas en el primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Chongqing desde abril de 2015 hasta marzo de 2021. Las muestras de sangre recolectadas se centrifugaron para obtener plasma a 3000 rpm durante 10 minutos. El plasma recogido se almacenó luego a -80 ° C para experimentos posteriores.
Animales
Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las pautas éticas de la Declaración de Helsinki de 1964 y recibieron la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Medicina de Chongqing (IACUC-CQMU-2023-0007).
Se adquirieron ratas macho Sprague -Dawley (180–200 g) del Centro de Animales Experimental de la Universidad de Medicina de Chongqing (Chongqing, China). Todas las ratas se colocaron en condiciones sin patógenos estándar con temperatura controlada (22 ± 2 ° C) y 12/12 h ciclo de luz/oscuridad. Las ratas en el grupo monocrotalina (MCT) fueron inyectadas intraperitonealmente con MCT (50 mg/kg, Mengbio, Chongqing, China), mientras que las ratas en el grupo control se inyectaron con el mismo volumen de solución salina. Luego, todas las ratas se alimentaron en las mismas condiciones durante 4 semanas.
Los ratones machos adultos (de aproximadamente 8 semanas), que pesaban entre 22 y 26 g de Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Las construcciones de clonación de ARN objetivo correspondientes y el virus asociado al adenovirus serotipo 9 (AAV9) fueron empaquetados por Genechem, Shanghai, China. Los ratones se asignaron aleatoriamente a varios grupos y, después de la anestesia de isoflurano, se les administró equivalentes del genoma 2 * 1011 del vector AAV9 en 50 μl de solución de PBS estéril a través de gotas nasales. 7 días después, los ratones se asignaron a entornos de normoxia o hipoxia, con las condiciones hipóxicas establecidas en una concentración de oxígeno al 10%, la alimentación de ratones y la ropa de cama se reemplazaron y se reemplazaron semanalmente.
Cultivo celular
Los PASMC primarios se aislaron de ratas Sprague -Dawley (6–8 semanas, 180–200 g) como se describió anteriormente (22). Brevemente, los tejidos pulmonares de rata se aislaron rápidamente después de sacrificar las ratas. Los tejidos de la arteria pulmonar se aislaron rápidamente y el tejido conectivo circundante se eliminó cuidadosamente. Los tejidos de la arteria pulmonar se pusieron en pedazos, dispersos uniformemente en placas de Petri, transferidos a una placa de cultivo con la mezcla de nutrientes/1% de la mezcla de nutrientes modificada de Dulbecco (DMEM/F-12) que contiene 20% de suero bovino fetal (FBS) y 1% Penicilina y estreptomicina, y se incubó en una incubadora humidificada a 37 ° C con 5% de CO2 y 21% de O2. Las células se cultivaron para 3-8 pasajes para experimentos posteriores.
Ensayo inmunosorbente unido a enzimas
Los niveles de proteína NCAM1 en muestras de plasma se cuantificaron utilizando kits ELISA (Ruixin Biotech, Quanzhou, China o Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd). Brevemente, se prepararon pozos de control en blanco, pozos estándar y pozos de muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se agregaron 100 µl de reactivo conjugado con HRP a cada pocillo, excluyendo los pozos en blanco. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 60 minutos y luego se sometieron a cinco ciclos de lavado. Después de los lavados, se añadieron 100 µl de solución de sustrato a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se terminó agregando 50 µl de solución de parada a cada pocillo, y la absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas, con el pozo en blanco que sirve como referencia cero. Para el análisis de la curva ROC, los niveles plasmáticos de proteína NCAM1 se midieron tanto en el grupo de control como en el grupo de pacientes con PH usando ELISA. Los datos resultantes se importaron al software GraphPad Prism 9.0, donde se empleó el método Wilson/Brown para calcular los intervalos de confianza del 95% para la construcción de la curva ROC.
Ecocardiografía
Después de administrar la anestesia, las ratas o ratones se colocaron sobre su espalda, y el pelaje en el área del pecho anterior se afeitó. La estructura y la función del corazón derecho se evaluaron utilizando un sistema de ultrasonido para realizar ecocardiografía. Se tomaron mediciones del diámetro transversal de aurícula derecho (RATD) y el diámetro transversal del ventrículo derecho (RVTD) desde la vista de cuatro cámaras del corazón en el modo de ultrasonido bidimensional. Además, la excursión sistólica del plano anular tricúspide (TAPSE) se evaluó en …
(Tagstotranslate) NCAM1 (T) PASMCS (T) PDGF-BB (T) ERK1/2 (T) Sistema de neumología/respiratoria
