Resumen
La esquiva patogénesis de la lesión pulmonar aguda (ALI) inducida por sepsis, combinada con la ausencia de biomarcadores de diagnóstico confiables, obstaculiza significativamente el desarrollo de terapias dirigidas y enfoques de medicina de precisión para los pacientes afectados. En este estudio, empleamos scRNA-seq para perfilar el panorama transcripcional de los pulmones en modelos murinos bien establecidos de ALI inducida por sepsis. Estos hallazgos se validaron aún más experimentalmente, lo que condujo a la identificación de biomarcadores candidatos de tres linajes para ALI asociada a sepsis: SCGB3A2 (en células epiteliales), AKAP12 (en células endoteliales) y CCL4 (en monocitos/macrófagos, Mo/Mφ). En el microambiente inmunológico pulmonar de la ALI inducida por sepsis, se identificaron Mo/Mφ como los contribuyentes dominantes a la heterogeneidad inmune pulmonar durante la fase inflamatoria aguda de la ALI inducida por sepsis. Entre estos, la subpoblación Ccl4high Mo/Mφ exhibió infiltración pulmonar específica de la enfermedad y un fenotipo proinflamatorio distinto. Mecánicamente, FPR1 estaba regulado positivamente en el grupo hiperinflamatorio de Ccl4high Mo/Mφ. La inhibición farmacológica de FPR1 in vivo redujo selectivamente la infiltración pulmonar de Ccl4high Mo/Mφ y atenuó la ALI inducida por sepsis. Además, establecimos un panel de cinco genes basado en sangre periférica (CCL4, NFKBIA, IL1B, BATF y XBP1) derivado de firmas de Ccl4high Mo/Mφ, que predijo de manera sólida la ALI inducida por sepsis en cohortes clínicas. En conjunto, nuestro trabajo delinea las alteraciones transcripcionales de los pulmones en la ALI inducida por sepsis, identifica biomarcadores candidatos para la ALI inducida por sepsis y establece un modelo de diagnóstico clínicamente aplicable para la detección temprana. Estos hallazgos mejoran nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de la ALI inducida por sepsis y ofrecen nuevos objetivos para su diagnóstico de precisión e intervención terapéutica.
Introducción
La sepsis es una disfunción multiorgánica potencialmente mortal causada por una respuesta desordenada del huésped a la infección. Conlleva altas tasas de morbilidad y mortalidad. El pulmón es particularmente vulnerable al daño inducido por la sepsis (1, 2). La lesión pulmonar aguda (ALI) inducida por sepsis puede progresar rápidamente a síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) e insuficiencia respiratoria, lo que la convierte en una de las principales causas de muerte en las unidades de cuidados intensivos (UCI) (3, 4). Los mecanismos de patogénesis de la ALI inducida por sepsis son complejos y aún no están claros.5, 6). Investigaciones anteriores sobre la patogénesis de la ALI inducida por sepsis se han centrado principalmente en componentes celulares individuales y carecían de una descripción sistemática de las alteraciones en el microambiente pulmonar.7, 8).
La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para examinar componentes y estados celulares específicos (9, 10). Varios estudios han aplicado scRNA-seq para caracterizar el espectro de estados de las células inmunes en la sangre periférica de pacientes con sepsis (11, 12). Sin embargo, las firmas de sangre periférica previamente identificadas pueden carecer de especificidad tisular para la ALI inducida por sepsis. Para resolver este problema, la scRNA-seq de tejidos pulmonares frescos de modelos de ALI inducida por sepsis puede proporcionar información valiosa sobre la remodelación dinámica del microambiente pulmonar y ayuda a identificar biomarcadores altamente específicos de tejido.
Las células epiteliales y endoteliales son los principales objetivos lesionados en la ALI inducida por sepsis. El seguimiento de su reprogramación transcripcional y su interacción con las células inmunes contribuye a dilucidar los mecanismos de la patogénesis de la ALI inducida por sepsis (13,14,15). Los monocitos/macrófagos (Mo/Mφ) desempeñan un papel central en la patogénesis de la ALI inducida por sepsis, exhibiendo una notable plasticidad y diversas funciones (defensa, inflamación, reparación).16,17,18). Actualmente, un esquema de clasificación binaria tradicional es ampliamente aceptado, clasificando los macrófagos en tipos proinflamatorios M1 y antiinflamatorios M2.19). Sin embargo, la dicotomía tradicional M1/M2 simplifica demasiado su heterogeneidad y abordar la polarización ha producido un beneficio clínico limitado.20). scRNA-seq ahora permite la identificación precisa de subconjuntos de Mo/Mφ específicos de la enfermedad. Esta comprensión refinada de la diversidad de macrófagos promete: (i) dilucidar mecanismos patogénicos no reconocidos previamente, (ii) facilitar el desarrollo de terapias inmunomoduladoras dirigidas y, en última instancia, mejorar los resultados clínicos en la ALI inducida por sepsis (21).
El ligando de quimiocina 4 con motivo CC (CCL4), producido por células estromales, células epiteliales, monocitos, linfocitos y neutrófilos, actúa como un potente atrayente para las células inmunes que expresan receptores CCR1/CCR5.22, 23). Si bien las investigaciones anteriores se centraron principalmente en la secreción de CCL4 y la quimiotaxis en los neutrófilos, la evidencia emergente subraya su papel fundamental en las respuestas inflamatorias mediadas por Mo/Mφ. El receptor 1 del péptido formil (FPR1) es un receptor acoplado a proteína G transmembrana (24) y es un importante receptor de reconocimiento de patrones en las células inmunes innatas. El papel de FPR1 en la lesión inflamatoria es controvertido. La sobreexpresión de FPR1 en la microglia exacerba las lesiones inflamatorias en el cerebro al regular la localización de los neutrófilos y la migración de otras células inmunes.25, 26). Por otro lado, la insuficiencia de FPR1 en ratones compromete la eliminación de patógenos, agravando la infección e inflamación y aumentando la mortalidad (27, 28). El papel de FPR1 en la patogénesis de la ALI inducida por sepsis no se ha estudiado en profundidad.
Aquí, realizamos scRNA-seq en tejidos pulmonares de modelos y controles murinos de ALI inducidos por sepsis bien establecidos. Identificamos nuevas subpoblaciones de células asociadas significativamente con la patogénesis de la ALI inducida por sepsis, incluidas las células epiteliales alveolares altas Scgb3a2, las células endoteliales altas Akap12 y Ccl4high Mo/Mφ. Además, proponemos un patrón de clasificación refinado para los estados de macrófagos específicos de ALI en sepsis y validamos experimentalmente el papel y el mecanismo de los subconjuntos proinflamatorios Ccl4high Mo/Mφ en la mediación de la lesión pulmonar. Estos hallazgos pueden ayudar a dilucidar la patogénesis de la ALI inducida por sepsis a través de conocimientos sobre la composición celular, el estado y la dinámica del microambiente pulmonar y pueden conducir al desarrollo de objetivos diagnósticos y terapéuticos para el flujo de trabajo clínico de la ALI inducida por sepsis.
Métodos
Recogida y procesamiento de muestras. Muestras de pacientes
Se recogieron muestras de sangre entera fresca de 16 pacientes diagnosticados con sepsis dentro de las 24 horas posteriores al ingreso a la UCI del hospital Nankai, Tianjin. De los 16 pacientes, 10 presentaron deterioro de la oxigenación (PaO2/FiO2 <300 mmHg) y fueron diagnosticados con ALI inducida por sepsis. Los 6 pacientes restantes con sepsis sin lesión pulmonar (PaO2/FiO2 ≥ 300 mmHg) se incluyeron como controles. El diagnóstico de sepsis se basó en la definición de Sepsis 3.0. Los criterios de inclusión incluyeron edad ≥ 18 años, un diagnóstico confirmado de sepsis y la capacidad de dar consentimiento informado. Las fuentes de infección de los pacientes se limitaron al tracto gastrointestinal, la pancreatitis y el sistema hepatobiliar, según la distribución de los casos dentro de nuestro departamento. Los criterios de exclusión incluyeron antecedentes de enfermedad respiratoria crónica, terapia inmunosupresora y edema pulmonar de origen cardíaco o negativa a participar. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes o de sus representantes legales. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Tianjin Nankai (N.º de aprobación NKYY_YXKT_IRB_2024_072_01). Todos los pacientes recibieron un monitoreo continuo de los signos vitales y fueron tratados de manera similar de acuerdo con las recomendaciones estandarizadas de nuestras UCI para garantizar la estabilidad hemodinámica antes de la recolección de la muestra. Se recogieron muestras de sangre el día del ingreso. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) dentro de las 2 h posteriores a la recolección. Las PBMC aisladas se criopreservaron en nitrógeno líquido hasta su posterior análisis.
muestras de animales
Para el estudio con animales, el Centro de Animales de Laboratorio del Hospital Nankai de Tianjin proporcionó ratones machos adultos C57BL/6J (de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 20 a 26 g). Los animales se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos (22–24 °C, ciclo de luz y oscuridad de 12 h) con acceso a agua y alimento ad libitum. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a dos grupos de camadas del mismo tamaño de 6 a 8 personas. Este estudio fue aprobado por el Comité de Bienestar y Ética Animal del Hospital Tianjin Nankai, Universidad Médica de Tianjin (N.º de aprobación NKYY_DWLL_2023_077).
Establecimiento de modelos ALI inducidos por sepsis.
Se establecieron modelos murinos de ALI inducida por sepsis utilizando lipopolisacárido (L4391, Sigma) o el procedimiento de ligadura y punción cecal (CLP). Después de la aleatorización, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 15 mg/kg de LPS o una dosis equivalente de vehículo PBS. Los ratones fueron monitoreados para detectar signos clínicos de angustia y se sacrificaron a las 18 h para la recolección y análisis de tejido. En el procedimiento CLP, los ratones fueron sometidos a cirugía CLP bajo anestesia. El ciego se ligó aproximadamente a dos tercios de su longitud desde la válvula ileocecal. El ciego se perforó mediante punción única y pasante a medio camino entre el punto de ligadura y la punta del ciego. La punción se realizó consistentemente en dirección mesentérica a antimesentérica. Se utilizaron agujas de calibre 20 en todos los procedimientos para garantizar un tamaño de punción uniforme. El ciego se puncionó dos veces a través del mismo orificio inicial (29). Luego se cerró el abdomen con suturas. Los ratones operados de forma simulada se sometieron al mismo procedimiento sin ligadura ni punción cecal. Todo el CLP y las operaciones de control correspondientes fueron realizadas por un técnico experimentado para minimizar la variación técnica. Se controló la supervivencia de los ratones durante un período de 48 horas y se recogieron tejidos pulmonares 18 h después de la cirugía para análisis histológicos y estudios moleculares.
Validación de modelos ALI inducidos por sepsis.
Doce horas después de la inyección intraperitoneal de LPS, el murino…
