Resumen
Antecedentes
La formación de la trampa extracelular de neutrófilos (neto) se ha implicado como un mecanismo patogénico tanto en la artritis reumatoide (AR) como en la enfermedad pulmonar intersticial (ILD). Sin embargo, el papel de las NET en ILD asociado a RA (RA-ILD) y los mecanismos que impulsan la formación neta siguen sin estar claros. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la participación de las redes en RA-ILD y dilucidar los mecanismos subyacentes.
Métodos
La secuenciación de células individuales se usó para identificar cambios en la cantidad y la función de los neutrófilos en el tejido pulmonar de un modelo de artritis de neumonía intersticial inducida por zimosan A (zym). Además, la interferencia del receptor nuclear 4A3 (NR4A3) se realizó en las células HL-60 para evaluar su impacto en la formación neta y la transformación de las células MRC-5 en miofibroblastos. La relevancia clínica del ADN de mieloperoxidasa plasmática (MPO-ADN), la histona 3 citrulinada (CIT-H3) y el ADN libre de células se evaluó en pacientes con ARA con diferentes tipos de imágenes a través de un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas comerciales (ELISA).
Resultados
En el modelo de ratón SKG tratado con Zym, que recapitula las características clave de RA-IDL, una mayor población de neutrófilos en el tejido pulmonar fue el principal responsable de la formación neta. Mecánicamente, encontramos que la interferencia con la expresión de NR4A3 mejoró la formación neta en las células HL-60, que a su vez promovieron la diferenciación de las células MRC-5 en miofibroblastos. Clínicamente, los niveles plasmáticos de ADN de ADNc se elevan en pacientes con neumonía intersticial de AR no específica (RA-NSIP), mientras que los niveles de CIT-H3 están elevados en la neumonía intersticial de la AR (RA-UIP) en comparación con los sujetos sanos. El análisis de la curva ROC reveló además que la combinación de MPO-ADN en plasma, el factor reumatoide (RF) y la proteína anticitrulada (anti-CCP) y la combinación de CIT-H3, RF y anti-CCP fueron paneles diagnósticos superiores para NSIP y UIP en pacientes con RAILD, respectivamente. Además, en comparación con los de controles sanos, los neutrófilos de pacientes con RA-UIP y RA-NSIP demostraron una capacidad significativamente aumentada para formar redes e inducir la diferenciación de las células MRC-5 en miofibroblastos. Específicamente, los pacientes con RA-UIP exhibieron una mayor capacidad para la formación neta y la diferenciación de las células MRC-5 en miofibroblastos que los pacientes con RA-NSIP.
Conclusiones
Estos hallazgos sugieren que las redes de orientación pueden ser un enfoque terapéutico novedoso para tratar ILD en pacientes con AR.
Introducción
La enfermedad pulmonar intersticial (ILD) es una complicación prevalente pero poco reconocida de la artritis reumatoide (AR) y perjudica significativamente los resultados del paciente (1, 2). Se ha informado que la tasa de supervivencia de los pacientes con RA-ILD es comparable a la de los pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (FPI), principalmente debido a su naturaleza progresiva y la disponibilidad limitada de opciones terapéuticas efectivas (3, 4). A pesar del impacto sustancial en el pronóstico del paciente, los mecanismos fisiopatológicos subyacentes siguen siendo poco conocidos. Por lo tanto, dilucidar las vías moleculares que impulsan RA-ILD es crucial para identificar nuevos objetivos terapéuticos.
ILD representa un grupo diverso de afecciones fibróticas e inflamatorias pulmonares (5). Aunque los mecanismos subyacentes a la desregulación de las cascadas inflamatorias y la remodelación del tejido en varias formas de RA-IDS siguen siendo oscuros, la evidencia acumuladora sugiere que los neutrófilos juegan un papel fundamental en la compleja interacción entre la inflamación y la fibrosis en este contexto (6, 7). Por ejemplo, los neutrófilos producen inhibidores tisulares de metaloproteinasas y elastasa de neutrófilos (NE), que juntos activan el factor de crecimiento transformador β (TGF-β) y reclutan otras células inflamatorias a los pulmones, promoviendo la fibrosis pulmonar (6). Además, los neutrófilos liberan trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que contienen cromatina unida a enzimas granulares y están implicadas tanto en la inflamación como en la fibrosis (6). Las redes son grandes estructuras similares a la web que consisten en proteínas citosólicas y granulares ensambladas en un andamio de cromatina decondenada que puede acumularse en los pulmones y exacerbar fibrosis ((8). La formación de NET es un proceso complejo que involucra múltiples mecanismos moleculares y vías de señalización. La formación de redes suicidas, inducida por forbol 12-myristato 13-acetato (PMA), complejos inmunes, o bacterias, activa NADPH oxidasa (NOX) para producir especies de oxígeno reactivo (ROS), que posteriormente activan la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NIN), lo que lleva a la deconsación de la cromatina y eventual de muerte. Por el contrario, la formación de redes vitales se desencadena por factores como las plaquetas o Staphylococcus aureus, que implican la liberación de ADN nuclear para formar redes mientras mantienen las funciones antibacterianas y secretoras de los neutrófilos. La formación de redes mitocondriales, impulsada por el factor estimulador de la colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) combinada con lipopolisacárido/complemento C5A (LPS/C5A), conduce a la liberación de ADN mitocondrial para formar NET, con neutrófilos que mantienen su actividad fisiológica. Además, la peptidilarginina deiminasa 4 (PADI4) se activa mediante canales de iones de calcio y luego se transloca al núcleo para mediar la citrulinación de histonas y la descondensación de la cromatina ((9).
Estudios recientes han destacado la contribución de las redes a la patogénesis de enfermedades inmunes, incluida la AR (10) y dermatomiositis (DM) ILD asociada a (11). Pérez-Sánchez et al. informaron que 6 meses de terapia con tacilizumab (TCZ) o infliximab no solo mejoraron la actividad de la enfermedad, sino que también redujeron la liberación de ADN extracelular al disminuir la formación neta en pacientes con AR (12). Además, el desarrollo de medicamentos que se dirigen a la formación neta representa una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de la AR (13). En el contexto de ILD, los pacientes con dermatomiositis (DM) positiva para autoanticuerpos (MDA5 AB+) positiva para el gen 5 asociado al antimelanoma tienen concentraciones más altas de ADN libre de circulación sérica que los pacientes con AB- DM anti-MDA5 (DM (14). En conjunto, la evidencia acumulada sugiere que las redes pueden contribuir al desarrollo de RA-IDL.
El receptor nuclear 4A3 (NR4A3), también conocido como receptor huérfano de neuronas 1 (NOR-1), es miembro de la subfamilia del receptor nuclear huérfano NR4A (15). Aunque NR4A3 se expresa en varios tipos de células, su papel funcional sigue siendo poco conocido. Varios estudios han demostrado que NR4A3 está regulado al alza en las células INS-1 cultivadas y los islotes pancreáticos humanos tratados con IL-1β y TNF-α. Curiosamente, la eliminación de NR4A3 reduce la apoptosis mediada por citocinas, mientras que la sobreexpresión de NR4A3 mejora la muerte de las células apoptóticas a través de vías proinflamatorias (16). Estos hallazgos indican que NR4A3 juega un papel proapoptótico. Además, la regulación negativa de NR4A3 conduce a una reducción en la transcripción de SDHA, que perjudica significativamente la producción de ATP mitocondrial, aumenta el estrés oxidativo y contribuye a la hipertrofia auricular, la fibrosis y la remodelación eléctrica (17). En particular, los niveles elevados de estrés oxidativo también se asocian con la formación excesiva de NET en enfermedades inflamatorias y autoinmunes (18). Estos datos sugieren que NR4A3 puede estar involucrado en la regulación de la formación neta.
Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue investigar la correlación entre NET y RA-ILD, explorar los mecanismos subyacentes que impulsan la formación neta y evaluar las implicaciones clínicas de estos hallazgos.
Materiales y métodos
Declaración de bienestar animal y generación de un modelo de ratón artrítico de neumonía intersticial inducida por Zymosan A
Todos los protocolos de ratones fueron aprobados por el Comité de Animales de Laboratorio de la Universidad de Ningxia de acuerdo con las directrices de la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para la atención y el uso de animales de laboratorio (KYLL-2024-1033). Todos los ratones fueron adquiridos de CLEA Japan Inc. (Tokio, Japón) y se alojaron en una instalación especial de patógenos en las instalaciones animales de la Universidad de Medicina de Ningxia (Yinchuan, China) con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, con alimentos y agua ad libitum. Para generar un modelo de ratón artrítico de neumonía intersticial, los ratones SKG/JCL de 8 semanas de edad (n = 12) se administraron intraperitonealmente 7,5 mg de zymosan A (Zym) (ALFA Aesar, Lancashire, Reino Unido) en 0.5 ml de salino salino fosfato (PBS). Los ratones de control (n = 12) se administraron 0,5 ml de PBS. El peso corporal y el tamaño de la pata se examinaron semanalmente. La puntuación de artritis para cada una de las cuatro patas se registró a través del siguiente sistema de puntuación: 0 = articulaciones normales; 1 = Ligera hinchazón o eritema del tobillo o mediopié; 2 = ligera hinchazón del tobillo y el pie; 3 = hinchazón moderado y eritema; y 4 = hinchazón severo y eritema (19). El puntaje máximo fue de 16 para cada mouse. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono (CO2) al final del experimento. Los tejidos, que incluyen sangre, articulaciones de la rodilla, cerebro, corazón, riñón, hígado, bazo, colon y pulmones, se cosecharon para el análisis patológico y molecular a las 8 y 16 semanas después del desafío de Zym.
Análisis histopatológico de pulmón y articular
Los tejidos pulmonares de ratón se fijaron en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% antes de ser incrustados en compuesto óptimo de temperatura de corte (OCT) o deshidratado y procesado para incrustación de parafina. Las secciones de cinco micrómetros de espesor se prepararon y se tiñeron usando hematoxilina y eosina (H&E), tricromo de Masson u otros métodos como se describe en otra parte (20). La gravedad de la lesión intersticial y la fibrosis en los tejidos pulmonares se evaluó evaluando la infiltración de células inflamatorias utilizando la escala Ashcroft, con puntajes que varían de 0 a 4 para lesiones intersticiales y 0 a 8 para fibrosis, basado en imágenes histológicas del pulmón como se describió anteriormente (se describió anteriormente ((21).
Los tejidos articulares se fijaron en formalina al 10%, se descalcificaron con EDTA, se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de cinco micrómetros de espesor. Se realizaron la tinción H&E y Toluidine Blue-O (TBO). El grado de inflamación articular y …
(Tagstotranslate) Receptor nuclear 4 (T) TRAPS extracelular de neutrófilos (T) Artritis reumatoide (T) Enfermedad pulmonar intersticial (T) Sistema de neumología/respiratorio
