Resumen
Antecedentes
En la EPOC, el equilibrio entre las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y sus inhibidores naturales (inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP)) se desplaza hacia la degradación excesiva, reflejada en el lavado broncoalveolar (BAL) como mayores concentraciones de MMP. Debido a su papel crítico en la homeostasis pulmonar, la actividad de MMP está estrechamente regulada, pero en qué medida este reglamento ocurre a través de mecanismos epigenéticos sigue siendo desconocido.
Métodos
Para explorar la interacción entre MMP, TIMP y metilación del ADN (DNAM), (1) analizamos las concentraciones de MMP-9, -12 y TIMP-1 en fluido BAL, y perfilamos DNAM en células BAL de 18 sujetos de control de EPOC y 30, (2) relaciones estimadas de proteína -COPD utilizando regresión multivariable, (3) loci de metilación de rasgos cuantitativos de proteínas identificadas (PQTMS) con EPOC como Un modificador potencial en un modelo de interacción separado y (4) integraron interacciones significativas con un metanálisis GWAS de EPOC previo.
Resultados
La EPOC se asoció con niveles más altos de BAL MMP-12 (P = 0.016) pero no con MMP-9 o TIMP-1. El examen más detallado de MMP-12 identificó la asociación con DNAM en 34 loci (PQTMS), con TGFBR2 (P = 2.25 × 10-10) y THBS4 (P = 1.11 × 10–9) entre los diez genes PQTM principales principales. El modelo de interacción identificó 66 sitios donde la asociación DNAM-MMP-12 fue significativamente diferente en la EPOC en comparación con los controles. De estos, uno fue colocalizado con SNP previamente asociados con EPOC.
Conclusiones
Nuestros hallazgos indican que las vías respiratorias MMP-12 pueden estar parcialmente reguladas por mecanismos epigenéticos y que esta regulación se interrumpe en la EPOC. Además, la integración con los datos de la EPOC GWAS sugiere que esta desregulación está influenciada por una combinación de factores ambientales, procesos de enfermedad y genética, con este último potencialmente desempeñando un papel menor.
Fondo
La matriz extracelular (ECM) de los pulmones está compuesta de proteínas y glucoproteínas como la elastina, diferentes tipos de colágenos y fibronectina. Además de proporcionar soporte estructural para células y vasos, el ECM también actúa como un espacio de almacenamiento para señalar moléculas (1).
Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) forman una familia significativa de enzimas proteolíticas capaces de degradar los componentes de ECM, al tiempo que modula la señalización de célula a célula, angiogénesis e inflamación. En los pulmones, los macrófagos alveolares y los fibroblastos pulmonares son las fuentes principales de MMP, con síntesis adicional por neutrófilos, linfocitos y células epiteliales ((2). La mayoría de las MMP se secretan como precursores inactivos y se activan extracelularmente por enzimas como serina proteinasas, por ejemplo, elastasa de neutrófilos u otros MMP ya activados.
Regulación de MMP
Para evitar la degradación no controlada de la ECM, la actividad de las MMP se regula a múltiples niveles: EG, expresión, secreción, activación extracelular e inhibición de la activación. La última función es llevada a cabo por un grupo de proteínas llamadas ‘inhibidores tisulares de metaloproteinasas’ (TIMPS), la mayoría de los cuales son inhibidores de amplio espectro que pueden impedir la actividad de todos los MMP, aunque algunos muestran afinidades más selectivas (3). La proteína plasmática α2-macroglobulina es otro inhibidor importante de la actividad de MMP, pero, a diferencia de TIMP, la α2-macroglobulina no se produce localmente en las vías respiratorias y, por lo tanto, está presente solo en concentraciones muy bajas.
EPOC, metilación del ADN y regulación MMP
En la EPOC, el equilibrio proteolítico en los pulmones se inclina hacia la degradación aberrante, como se refleja en el lavado broncoalveolar (BAL) por mayores concentraciones de múltiples MMP, incluidos MMP-9 y MMP-12. Aunque las modificaciones epigenéticas como la metilación del ADN (DNAM) están implicadas en la patogénesis de la EPOC (4), no se ha examinado su papel específico en la remodelación de ECM y la regulación proteolítica. Las ideas potenciales sobre cómo DNAM influye en estos procesos se pueden obtener de los estudios de desequilibrios proteolíticos en otras afecciones inflamatorias. En la osteoartritis, por ejemplo, una mayor producción de MMP se ha relacionado con la desmetilación en sus regiones promotoras genéticas, lo que se cree que conduce a una síntesis mejorada y una degradación posterior del cartílago (5). Los cambios en los patrones de condrocitos DNAM también pueden contribuir a la cronicidad de la enfermedad, ya que los estados de metilación se transmiten durante la división celular. Del mismo modo, en la retinopatía diabética, la mayor expresión de MMP-9 en la retina y sus capilares parece mantenerse a través de cambios en el metiloma (6).
MMP-9, MMP-12 y TIMP-1
MMP-9 y MMP-12 comparten varias características más allá de sus niveles aumentados en las vías respiratorias de COPD. Ambos pueden descomponer la elastina y están sujetos a la inhibición por TIMP-1, y ambos se han propuesto como biomarcadores potenciales de EPOC y como objetivos adecuados para las intervenciones farmacéuticas (7). Las diferencias clave incluyen sus (i) orígenes celulares: MMP-12 se sintetiza principalmente por los macrófagos, mientras que MMP-9 se produce en cantidades significativas por una variedad de tipos de células; (ii) Especificidad del sustrato: MMP-12 tiene una afinidad pronunciada por la elastina, mientras que MMP-9 también puede degradar algunos colágenos y gelatina; y (iii) roles en la patogénesis de la EPOC: MMP-12 está implicados prominentemente en la formación de enfisema, mientras que ambos MMP participan en la regulación de la inflamación. TIMP-1 se expresa altamente en los pulmones y se cree que juega un papel crucial en la homeostasis de ECM a través de la inhibición de la actividad excesiva de MMP.
Anteriormente hemos informado una fuerte asociación entre los patrones de EPOC y DNAM en células BAL (8). Muchas de las vías implicadas se vincularon con la remodelación de ECM y las MMP, incluida la señalización de factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), adhesión celular y remodelación de tejidos. Continuando con estos hallazgos, el presente estudio tiene como objetivo explorar la interacción entre MMP, sus inhibidores naturales y DNAM en el contexto de la EPOC. Algunos de los resultados se han informado previamente en forma de resumen (9).
Métodos
Para una visión general de los métodos utilizados en el estudio, ver Fig. 1.
Descripción general del estudio. Se midió la metilación del ADN en las células BAL y las concentraciones de proteínas MMP-9, MMP-12 y TIMP-1 en el líquido BAL. La relación entre la EPOC y las concentraciones de proteínas se probó utilizando una regresión multivariable, y las proteínas que exhibían asociaciones significativas se examinaron más a fondo en un estudio de asociación de proteína-epigenoma (PEWAS). Para evaluar el efecto de la EPOC sobre las relaciones de metilación de proteínas-ADN, se implementó una interacción PEWAS. Todos los PQTM se anotaron a los genes, y la interacción PQTMS se probó para la colocalización con la variación genética asociada con la EPOC. BAL: lavado broncoalveolar; MMP: metaloproteinasa de matriz; TIMP: inhibidor tisular de metaloproteinasas; GRANDE: Herramienta de enriquecimiento de regiones genómicas de anotaciones; GWAS: Estudio de asociación en todo el genoma; PQTM: loci de metilación del rasgo cuantitativo de proteínas; UCSC: Base de datos del navegador de la Universidad de California, Santa Cruz, Genome
Sujetos de estudio
Veintidós sujetos con EPOC y treinta controles con función pulmonar normal participaron en este estudio transversal. Todos fueron reclutados del estudio de EPOC de OLIN longitudinal (enfermedad pulmonar obstructiva en el norte de Suecia) utilizando criterios predeterminados, consulte el archivo complementario en línea para obtener más detalles.
Broncoscopia y análisis de laboratorio
Todos los sujetos se sometieron a broncoscopia con BAL. Tres sujetos de EPOC no pudieron completar el procedimiento de broncoscopia. Para un sujeto, la tasa de recuperación de BAL, el porcentaje de la solución salina inculcada que se recupera con éxito, fue demasiado baja para habilitar los análisis. Las concentraciones de BAL de MMP-9, MMP-12 y TIMP-1 se analizaron utilizando kits de ensayo inmunosorbentes ligados a enzimas disponibles comercialmente. El DNAM en las células BAL se midió utilizando 850 K de BeadChip de Metilationepic de Illumina, consulte el archivo complementario en línea para obtener más detalles.
Anátelos estadísticos: Airway MMPS/TIMP-1 y EPOC
Se utilizaron modelos de regresión multivariable para probar asociaciones entre EPOC y los niveles de MMP/TIMP-1 en BAL. Las concentraciones de proteínas se transformaron utilizando una transformación normal inversa basada en rango. Se incluyeron sexo, edad, uso inhalado de corticosteroides (ICS), años de paquete e intensidad de fumar (número de cigarrillos ahumados/día) como covariables en los modelos. Consulte el archivo complementario en línea para obtener más detalles.
Análisis estadísticos: la metilación del ADN y su asociación con los niveles de proteínas
Se realizó un estudio de asociación de proteína-epigenoma (PEWAS) para evaluar la asociación entre los valores de DNAM β y los niveles de proteínas. Para realizar este análisis, utilizamos una regresión lineal robusta (RLM en el paquete Mass R). Los ajustes incluyeron el estado de la EPOC, el sexo, la edad (en años), el uso de ICS, los años de la manada, la intensidad del tabaquismo y los recuentos de tipo de célula (incluidos los macrófagos, los linfocitos, los neutrófilos y los eosinófilos). Se aplicó un modelo de interacción para evaluar el impacto de la EPOC en las relaciones entre los niveles de proteínas y DNAM. Para abordar el problema de las pruebas múltiples, implementamos la corrección de Bonferroni (p <6.74 × 10-8).
Anátelos estadísticos: integración con GWAS
Los loci de metilación del rasgo cuantitativo de proteínas (PQTMS) modificados significativamente por el estado de la EPOC se compararon con los 82 SNP de un metanálisis reciente de GWAS (10). Examinamos si los PQTM de interacción en el presente estudio se ubicaron dentro de una ventana de 500 kb aguas arriba y 500 kb aguas abajo de estos SNP.
Resultados
Los datos sobre los niveles de MMP-9, MMP-12 y TIMP-1 en BAL y DNAM en células BAL estaban disponibles para 18 sujetos con EPOC y 30 controles (tabla 1). No hubo diferencias significativas en la edad o el índice de masa corporal entre pacientes y controles. Como se esperaba, solo los sujetos de EPOC usaron corticosteroides inhalados. El grupo con EPOC tenía una mayor proporción de fumadores actuales, un mayor número de años de paquete y, en línea con estudios previos, una tasa de recuperación de BAL más baja. Entre los fumadores actuales, la intensidad del tabaquismo fue mayor en sujetos con EPOC. Los recuentos de células diferenciales mostraron que los linfocitos eran más bajos en la EPOC en comparación con los controles, y como …
(Tagstotransilato) Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) (T) metilación del ADN (T) Metaloproteinasas de matriz (MMP) (T) remodelación extracelular de la matriz (T) multiómica (T) broncoscopia (T) neumología/sistema respiratorio
