Resumen
Las formas progresivas de enfermedades pulmonares intersticiales, incluida la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), son trastornos mortales que carecen de biomarcadores no invasivos para la evaluación de la actividad de la enfermedad temprana, que presenta un obstáculo importante en el manejo de la enfermedad. La deposición excesiva de la matriz extracelular (ECM) es un sello distintivo de estos trastornos, con la fibronectina como una glucoproteína ECM abundante que está altamente regulada en la fibrosis temprana y sirve como andamio para la deposición de otras proteínas de la matriz. Debido a su papel en la fibrosis activa, estamos dirigidos a la fibronectina como un biomarcador de la actividad temprana de la enfermedad de la fibrosis pulmonar a través del polipéptido de unión a fibronectina PEGilado (PEG-FUD). En este trabajo, demostramos la unión de PEG-FUD al pulmón fibrótico a lo largo del curso del modelo murino inducido por bleomicina de fibrosis pulmonar. Primero analizamos la unión de PEG-FUD radiolabelado después de la incubación directa a cortes pulmonares cortados de precisión de ratones en diferentes etapas de fibrosis pulmonar experimental. Luego, administramos subcutáneos de PEG-FUD marcados con fluorescencia a ratones en el curso de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y evaluamos la absorción de péptidos 24 h más tarde a través de imágenes de tejido ex vivo. Utilizando ambos métodos, encontramos que el péptido dirigido al pulmón fibrótico aumenta durante la fase fibrogénica de la dosis única del modelo de fibrosis pulmonar de bleomicina (días 7 y 14 post-bleicina). En estos puntos de tiempo encontramos una relación correlativa entre la absorción de péptidos y la carga fibrótica. Estos datos sugieren que PEG-FUD se dirige a la fibronectina asociada con la fibrogénesis activa en este modelo, por lo que es un candidato prometedor para una sonda de imagen molecular clínicamente traducible para determinar no invasivamente la actividad de la enfermedad de la fibrosis pulmonar, permitiendo la toma de decisiones terapéuticas aceleradas.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una forma progresiva e irreversible de enfermedad pulmonar intersticial (ILD) con una duración mediana de supervivencia de 2 a 5 años después del diagnóstico (1, 2). In addition to IPF, other ILDs, including hypersensitivity pneumonitis, nonspecific interstitial pneumonia and connective-tissue related ILDs, may develop into progressive disease described by worsening respiratory symptoms, decline in lung function, increasing fibrosis on high resolution computed tomography (HRCT), and premature mortality (3). La ausencia de biomarcadores no invasivos confiables para la detección temprana de la progresión de la enfermedad activa es un obstáculo importante en el cuidado de pacientes con estas enfermedades. Los métodos actuales para evaluar la progresión de la enfermedad, incluidas las pruebas de HRCT y la función pulmonar, solo pueden proporcionar un monitoreo retrospectivo de la actividad de la enfermedad al comparar las pruebas de los meses anteriores (4, 5). El desarrollo de biomarcadores con alta fidelidad a la actividad de la enfermedad es una gran necesidad en el campo, con una investigación activa sobre firmas transcripcionales, proteómicas y metabólicas características que predicen la progresión de la enfermedad (6,7,8). Un biomarcador ideal para la fibrosis pulmonar progresiva proporcionaría información única en tiempo real sobre ese estado de enfermedad (nivel de actividad), que ofrece información aditiva a los métodos utilizados actualmente que pueden determinar la carga fibrótica general.
Además de los biomarcadores tradicionales basados en bioespecímenes, los biomarcadores de imágenes son un enfoque potencialmente ventajoso para los procesos de enfermedad de sondeo no invasivo, como los mecanismos de enfermedad aberrante, incluidos los metabolismos de glucosa mejorados (9,10,11), actividad celular (12,13,14,15,16) y deposición de matriz extracelular (ECM) (17,18,19,20). Dado que la deposición de ECM es un sello distintivo en el desarrollo de trastornos fibrosantes, sondas de imágenes moleculares que se dirigen a los mecanismos de deposición de ECM es prometedor para la detección de la actividad de la enfermedad. En particular, la glucoproteína ECM fibronectina (FN) juega un papel fundamental en el desarrollo de fibrosis pulmonares, donde sirve como un regulador clave en la deposición de colágeno y otros componentes de ECM ((21,22,23,24). Su alta y diferencial regulación al alza en los tejidos fibróticos, especialmente en los focos fibroblásticos que producen ECM en la FPI, y la asociación de niveles elevados de FN con la progresión de la enfermedad de la fibrosis pulmonar, marquéelo como un objetivo potencialmente útil para monitorear la actividad de la enfermedad clínica ((6, 23,24,25).
El dominio funcional aguas arriba (FUD, también conocido como PUR4), es un péptido de 6 kd derivado de la adhesina de Streptococcus pyogenes F1 que tiene una alta afinidad de unión al extremo N de FN y se muestra prometedor como una sonda molecular para dirigirse a FN en el contexto de la fibrosis pulmonar (19, 26, 27). Al modificar el FUD con 20 kd de polietilenglicol (PEG), al tiempo que preservamos su afinidad nanomolar por el dominio de FN de 70 kd de 70 kd, hemos mejorado su estabilidad y tiempo de circulación, mejorando así su capacidad para apuntar a áreas ricas en FN en tejidos fibróticos in Vivo (28,29,30). Nuestro trabajo anterior demostró la capacidad de PEG-FUD para servir como una sonda de imagen molecular para la fibrosis pulmonar (19). Sin embargo, se desconoce la dinámica de la absorción pulmonar de PEG-FUD durante las diferentes fases del desarrollo y resolución de la fibrosis pulmonar. Por lo tanto, esto posee implicaciones para la utilidad de la sonda en la práctica clínica eventual. Aquí, caracterizamos la focalización diferencial de nuestro péptido durante la evolución temporal del modelo murino inducido por bleomicina de fibrosis pulmonar al determinar la unión directa de PEG radiomarcado en las cortes pulmonares de corte de precisión (PCL) a partir de pulmones fibróticos y localización del péptido con fluorescencia con fluorescencia en el entorno de los tismones de los vivos. 1).
Estudiar diseño experimental. La bleomicina se administró intratraqueal a los pulmones de ratón para inducir fibrosis, caracterizada por una mayor expresión de fibronectina. El péptido PEGilado (PEG-FUD) se dirige a la región N-terminal de 70 kDa de fibronectina y se ha examinado como una sonda de imagen para la fibrosis pulmonar. Para comprender la absorción temporal de PEG-FUD en el modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, se utilizaron dos enfoques en varios puntos de tiempo a lo largo de este modelo. ARRIBA: Las rodajas pulmonares cortadas con precisión de los pulmones de ratón fibrótico se incubaron con péptido radiomarcado ((64CU) Cu-PEG-FUD) y la radiactividad se cuantificó mediante recuento gamma y autorradiografía. Abajo: el péptido marcado con fluorescencia (CY5-PEG-FUD) se administró a ratones subcutáneamente, seguido de imágenes relevantes de fluorescencia IVIS ex vivo y cuantificación de señal. La figura fue creada en Biorender.com
Mostramos que la absorción de la sonda PEG-FUD aumenta durante la fase fibrogénica de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y que el nivel de orientación de péptidos se correlaciona con la fibrosis general durante estas etapas. Estos hallazgos brindan un apoyo adicional para el uso de PEG-FUD como sonda para la actividad de la enfermedad temprana en la fibrosis pulmonar, validando adicionalmente su traducción potencial al uso clínico, donde podría ofrecer a los equipos de atención pulmonar una visión más detallada y precisa del estado de la enfermedad de los pacientes y la necesidad de intervención terapéutica. Partes de estos datos se han presentado previamente en forma abstracta (31,32,33).
Métodos
Diseño de estudio
Nuestro estudio fue diseñado para determinar la capacidad de unión de nuestro péptido dirigido a FN, PEG-FUD, en el curso de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (Fig. 2). Basado en nuestros hallazgos anteriores con el tejido IPF ex vivo, planteamos la hipótesis de que PEG-FUD puede apuntar a la fase fibrogénica en este modelo (19). Por lo tanto, primero preparamos y analizamos el péptido PEGilado, seguido de radiolabeling con 64CU, para cuantificar su absorción ex vivo en PCL derivadas de ratones a diferentes fases del modelo inducido por bleomicina. En segundo lugar, realizamos estudios de toxicidad de dosis individuales, asegurando que nuestro péptido no haya resultado en ningún efecto adverso. Dados los resultados alentadores de estos estudios, finalmente administramos el péptido marcado con fluorescencia (Cy5-PEG-FUD) a ratones in vivo, seguido de la cuantificación de la absorción en los pulmones de ratón, así como otros órganos relevantes durante el modelo de bleomicina. Los ratones fueron seleccionados al azar para la colocación del grupo. Los investigadores cegados a los grupos de tratamiento seleccionaron las muestras y realizaron análisis de imágenes.
Síntesis de péptidos, caracterización y conjugación reportera
El péptido FUD y el control mutante de control (MFUD), con alteraciones para reducir significativamente la afinidad de unión del péptido a FN (34), se produjeron recombinantemente usando BL21 E. coli (DE3) y el vector PET-Elmer, como antes (28,29,30). La purificación de péptidos se realizó utilizando cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) con una columna HP HP HP (Cytiva, Marlborough, MA, EE. UU.) Producir un solo pico para FUD y MFUD. The binding affinity of FUD and mFUD for FN was assessed by competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using 0.5 nM biotinylated FUD (b-FUD) along with varying concentrations of unlabeled FUD and mFUD (2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, and 0 nM) and absorbance was subsequently measured at 405 nm using a lector de microplacas para cuantificar la afinidad de enlace, como se describió anteriormente (27, 30, 35). A continuación, los péptidos FUD o MFUD purificados por FPLC se conjugaron n-terminalmente con un metoxi-PEG-Propionaldehyde de 20 kDa (NOF America Corporation, White Plains, NY, EE. UU.), Como se describió anteriormente ((28, 30). Los péptidos conjugados con PEG se purificaron usando FPLC y la identidad de péptidos PEGilado se confirmó usando el análisis MALDI-TOF (28, 30). La concentración de los conjugados PEG-FUD y PEG-MFUD se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm, utilizando el valor de coeficientes de extinción específicos (ε) para FUD (0.496) y MFUD (0.742). Los péptidos PeLatados purificados se conjugaron con reporteros apropiados, incluidos P-SCN-BN-Nota (Nota; Macrocíclicos, Dallas, TX, EE. UU.) O Sulfo-Cy5-NHS-ESTER (Lumiprobe, MD, EE. UU.), Como se describió anteriormente (30, 36, 37). Para habilitar radiolabeling, se usaron columnas PD-10 (Cytiva, Marlborough, MA, EE. UU.) Para purificar Nada-Peg-Fud de Nota no conjugada. 64CU fue producido utilizando métodos publicados por …
(Tagstotranslate) Péptido recombinante (T) Fibrosis pulmonar (T) Imágenes (T) Biomarcador no invasivo (T) Fibronectina (T) Sistema de neumología/respiratorio
