Resumen
La interleucina (IL)-8, también conocida como ligando 8 de quimiocina (motivo CXC), contribuye a la patogénesis del asma neutrofílica. La trombina exacerba las respuestas inflamatorias mediadas por IL-8/CXCL8. Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. La fosforilación de la serina/treonina quinasa 33 (STK33) por la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) se ha implicado en la metástasis del cáncer de pulmón, pero aún no se ha determinado su papel en la inflamación de las vías respiratorias inducida por trombina. En este estudio, investigamos si STK33 media la liberación de IL-8/CXCL8 inducida por trombina de las células epiteliales de las vías respiratorias en el asma grave. La secuenciación de ARN unicelular reveló una expresión de STK33 regulada positivamente en células epiteliales bronquiales de pacientes con asma grave. La tinción de inmunofluorescencia indicó una mayor coexpresión de STK33 y la proteína inflamatoria 2 de macrófagos (homólogo murino de IL-8/CXCL8) en las células epiteliales de las vías respiratorias de ratones con asma inducida por ovoalbúmina y ácaros del polvo doméstico. La trombina indujo la fosforilación de STK33 en residuos de serina. En particular, la eliminación de STK33 inhibió notablemente la liberación de IL-8/CXCL8 inducida por trombina de las células A549 y BEAS-2B. La trombina también indujo la formación de un complejo ERK-STK33, y la eliminación de STK33 redujo la fosforilación de ERK inducida por trombina. La colocalización de STK33, pc-Myc y trombina aumentó en ratones asmáticos. Además, la trombina aumentó la fosforilación de c-Myc en células A549; Este aumento en la fosforilación de c-Myc se atenuó significativamente por la inhibición de ERK (tratamiento con U0126) y la eliminación de STK33. Además, la trombina promovió la unión de c-Myc al promotor IL-8/CXCL8, y la eliminación de c-Myc suprimió la liberación de IL-8/CXCL8 inducida por trombina de las células A549 y BEAS-2B. En conjunto, estos hallazgos indican que la trombina induce la liberación de IL-8/CXCL8 a través de la vía ERK/STK33/c-Myc, destacando a STK33 como un objetivo terapéutico potencial en el asma grave.
Introducción
El asma es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica caracterizada por limitación variable del flujo de aire espiratorio y manifestaciones clínicas como hiperreactividad de las vías respiratorias, hiperproducción de moco, disnea, sibilancias, opresión en el pecho e inflamación persistente de las vías respiratorias.1). Un elemento central de la fisiopatología del asma es la inflamación crónica de las vías respiratorias. Las células epiteliales de las vías respiratorias sirven como barreras estructurales e inmunológicas contra las agresiones ambientales. La exposición a estímulos ambientales como partículas y alérgenos puede dañar estas células, mejorando la liberación de citoquinas proinflamatorias derivadas del epitelio, por ejemplo, interleucina (IL)-8, también conocida como ligando 8 de quimiocina (motivo CXC), e iniciando cascadas inflamatorias posteriores que impulsan la progresión del asma.2,3,4).
IL-8/CXCL8 es una quimiocina clave que facilita el reclutamiento de neutrófilos en los sitios de inflamación, contribuyendo a la patogénesis del asma neutrofílica, un subtipo para el cual aún no se dispone de estrategias terapéuticas efectivas.2, 5). En particular, se observó una expresión elevada de IL-8/CXCL8 en las secreciones de las vías respiratorias de pacientes con asma grave y se asocia con una mayor infiltración de neutrófilos en las células epiteliales de las vías respiratorias.6). Por lo tanto, dilucidar los mecanismos subyacentes a la expresión de IL-8/CXCL8 durante la inflamación de las vías respiratorias en el asma es crucial para identificar posibles objetivos terapéuticos.
La trombina es una serina proteasa implicada en la cascada de la coagulación (7). Además de facilitar la conversión de fibrinógeno en fibrina, la trombina exacerba la inflamación alérgica y la hiperreactividad de las vías respiratorias.8, 9). El daño epitelial conduce a la liberación de trombina, que luego se une a receptores activados por proteasas en las células epiteliales del pulmón. La activación de estos receptores induce la secreción de varios mediadores inflamatorios, como IL-8/CXCL-8, IL-6 y prostaglandina E2, lo que resulta en inflamación crónica de las vías respiratorias.10, 11). Los estudios han revelado niveles elevados de trombina en las vías respiratorias de pacientes con asma (12, 13). La estimulación de las vías respiratorias con trombina aumenta notablemente el nivel de la proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-2), el homólogo murino de la IL-8/CXCL8 humana, en el líquido de lavado broncoalveolar.10). Estos hallazgos subrayan el papel fundamental de la trombina en el impulso de las respuestas inflamatorias de las vías respiratorias en el asma.
La serina/treonina quinasa 33 (STK33) es una serina quinasa expresada predominantemente en células epiteliales testiculares, células epiteliales pulmonares y macrófagos alveolares.14, 15). La fosforilación de STK33 en la serina 496 regula la progresión del ciclo celular en las células HeLa (16, 17). La fosforilación de STK33 por la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) conduce a reordenamientos dinámicos del citoesqueleto, lo que facilita la metástasis, particularmente en los cánceres de pulmón y colorrectal.15). Nuestro análisis previo de datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de pacientes con asma reveló una expresión de STK33 significativamente aumentada en las células epiteliales bronquiales. Sin embargo, el papel de STK33 en la expresión de IL-8/CXCL8 inducida por trombina y su relevancia para la patogénesis del asma siguen sin explorarse.
En particular, c-Myc es un factor de transcripción pleiotrópico que regula la proliferación celular, la diferenciación celular, la progresión del ciclo celular y la apoptosis, facilitando la patogénesis de varios cánceres.18,19,20). La hipoxia mejora la actividad de c-Myc a través del factor 2α inducible por hipoxia, regulando así la expresión de IL-8/CXCL8 en células endoteliales humanas.21). En pacientes con asma, la expresión de c-Myc está considerablemente aumentada en las células linfoides innatas tipo 2. La exposición a alérgenos hace que las células epiteliales de las vías respiratorias liberen citocinas como IL-25 e IL-33, que posteriormente inducen la expresión de c-Myc, promoviendo así la inflamación de las vías respiratorias, la hiperproducción de moco y la hiperreactividad de las vías respiratorias.22). En conjunto, estos hallazgos implican a c-Myc en la expresión de IL-8/CXCL8 en células epiteliales y en la progresión patológica del asma. STK33 mejora la actividad transcripcional de c-Myc, regulando así la proliferación y diferenciación de células de carcinoma hepatocelular (23). Sin embargo, aún no está claro si la trombina induce la expresión de IL-8/CXCL8 a través de la activación de c-Myc mediada por STK33.
En este estudio, investigamos si STK33 media la liberación de IL-8/CXCL8 inducida por trombina de las células epiteliales del pulmón en el asma grave. Los resultados revelaron que la expresión de STK33 estaba regulada positivamente en las células epiteliales de las vías respiratorias de pacientes con asma grave. Además, la trombina indujo la formación de un complejo ERK-STK33, lo que llevó a la fosforilación y activación de c-Myc, lo que a su vez aumentó la expresión y liberación de IL-8/CXCL8 de las células epiteliales del pulmón humano.
Materiales y métodos
Materiales
La línea celular epitelial del pulmón humano A549 (CCL-185) y la línea celular epitelial bronquial humana BEAS-2B (CRL-9609) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE. UU.). La solución antibiótica-antimicótica (30-004-CI) se adquirió de Corning Mediatech (Manassas, VA, EE. UU.). El inhibidor de ERK (U0126), el anticuerpo de α-tubulina (T9026), la trombina (T4648), el hidróxido de aluminio, la ovoalbúmina, el ARN de interferencia pequeño de control (ARNip codificado), el ARNip de STK33 y el ARNip de c-Myc se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). NovaHisto (20X; LB0200-0100) se adquirió de Bionovas (Toronto, ON, Canadá). El anticuerpo IL-8/CXCL8 (bs-0780R) y el anticuerpo del fragmento 1 del péptido de activación de trombina, conjugado con Cy5 (bs-10387R-Cy5) se adquirieron de Bioss (Woburn, MA, EE. UU.). Anticuerpo anti-STK33 (ab237759), inmunoglobulina (Ig)G anti-conejo de cabra H&L Alexa Fluor 555 (ab150078), anticuerpos secundarios IgG anti-conejo de cabra H&L Alexa Fluor 488 (ab150077) y medio de montaje con 4′,6-diamidino-2-fenilindol-acuoso, escudo fluorado (ab104139) se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos contra ERK1/2 (sc-514302), ERK fosforilada (sc-7383) y STK33 (sc-376498), así como IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa picante, IgG anti-ratón, perlas de proteína G e IgG anti-ratón (sc-2314) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, EE. UU.). El anticuerpo c-Myc (PK-9; IRM309) se adquirió de iREAL Biotechnology (ciudad de Hsinchu, Taiwán). El anticuerpo policlonal fosforilado c-Myc (Ser62) (PA5-104729), Lipofectamine 3000, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/mezcla de nutrientes F-12 (F-12) y suero bovino fetal se adquirieron de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, EE. UU.). Se obtuvo un kit de ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de Upstate Biotechnology Millipore (Lake Placid, NY, EE. UU.). El medio de suero reducido Opti-MEM I (31985070) se adquirió de Gibco (Waltham, MA, EE. UU.).
Colección de tejido pulmonar humano
Los criterios de selección de la población se han descrito anteriormente (24). Los participantes incluyeron personas con asma grave, caracterizada por una función pulmonar persistentemente reducida (FEV₁ post-broncodilatador <60 % de lo previsto), así como controles sanos con función pulmonar preservada (FEV₁ >80 % de lo previsto). Se recogieron muestras de tejido de las vías respiratorias de pacientes con asma grave mediante broncoscopia. Las muestras fueron sometidas a tinción inmunohistoquímica. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.
Secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de tejido de las vías respiratorias humanas
Se obtuvo tejido de control sano de la tráquea de un no fumador, como se menciona en el conjunto de datos publicado anteriormente GSE134174 (25). Se recogieron biopsias de tejido de las vías respiratorias con asma grave de cinco pacientes y se procesaron inmediatamente para scRNA-seq. Las muestras de tejido se transfirieron a DMEM helado que contenía colagenasa, proteinasa y ADNasa I y se disociaron enzimáticamente a 37 °C con agitación suave para obtener una suspensión unicelular. La suspensión se pasó a través de un filtro celular de 70 µm para eliminar restos y fragmentos de tejido no digeridos. Después de la lisis y el lavado de los glóbulos rojos, se evaluaron la viabilidad y densidad celular mediante exclusión con azul tripano. Las bibliotecas unicelulares se prepararon utilizando Chromium Single Cell 3’…
