Resumen
Antecedentes
La remodelación de las vías respiratorias, una característica crítica del asma grave, implica una desregulación de la matriz extracelular (MEC) impulsada por fibroblastos. Si bien la IL-5 es fundamental en la inflamación eosinofílica, su papel directo en la fibrosis mediada por fibroblastos aún no está definido.
Métodos
Se estimularon fibroblastos de pulmón primarios de donantes asmáticos y sanos con 0,5 ng/ml de IL-5 durante varios momentos. Los componentes de la ECM, las metaloproteinasas de la matriz (MMP), el inhibidor tisular de las metaloproteinasas (TIMP) y las citocinas se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), Western blot, ELISA y citometría de flujo. La secuenciación de ARN y el análisis de enriquecimiento absoluto de conjuntos de genes (absGSEA) identificaron vías de señalización. La apoptosis se evaluó mediante tinción con anexina V/PI.
Resultados
Se ha demostrado que la IL-5 aumenta notablemente la expresión de las proteínas de la MEC, incluido el colágeno I y la fibronectina, en los fibroblastos asmáticos. También reguló positivamente la expresión de MMP-2 y MMP-3, junto con mayores niveles de TIMP-1 y TIMP-2. Además, la IL-5 promovió la secreción de IL-6 y TGF-β. El análisis de RNA-seq identificó 472 genes expresados diferencialmente en fibroblastos asmáticos, destacando la activación de la vía MAPK y la supresión de la apoptosis a través de la regulación positiva de NR4A1. La IL-5 redujo aún más la apoptosis de los fibroblastos y mejoró la expresión de IL-5Rα, lo que indica una posible señalización autocrina.
Conclusión
La IL-5 activa directamente los fibroblastos pulmonares para impulsar la remodelación de las vías respiratorias en el asma grave mediante el depósito de ECM, el desequilibrio MMP/TIMP y la secreción de citoquinas profibróticas, posicionándola como un mediador dual de la inflamación y la fibrosis con un nuevo potencial terapéutico.
Resumen gráfico
Introducción
El asma es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica multifactorial caracterizada por una obstrucción variable de las vías respiratorias debido a una respuesta inmune tipo 2 exagerada. Esta respuesta, mediada principalmente por células T colaboradoras 2 (Th2), involucra citoquinas clave como la interleucina (IL) -4, IL-5 e IL-13, que impulsan la inflamación y la hipersensibilidad de las vías respiratorias.1). La inflamación crónica en el asma conduce a una reparación tisular aberrante, lo que resulta en alteraciones estructurales denominadas colectivamente remodelación de las vías respiratorias.2). La remodelación de las vías respiratorias abarca daño epitelial, fibrosis subepitelial, aumento de la masa del músculo liso de las vías respiratorias, hiperplasia de células caliciformes y angiogénesis.3). Estos cambios contribuyen al estrechamiento irreversible o parcialmente reversible de las vías respiratorias y al aumento de la gravedad de la enfermedad (4).
Entre las características patológicas de la remodelación de las vías respiratorias, la fibrosis subepitelial es particularmente crítica debido a su asociación con la gravedad de la enfermedad y la rigidez de las vías respiratorias. Este proceso implica una deposición excesiva y una degradación deteriorada de los componentes de la MEC, incluidos el colágeno I, III y V, fibronectina, tenascina-C y lumican, dentro de la lámina reticular debajo de la membrana basal.4). La desregulación del recambio de la ECM resulta de un desequilibrio entre las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y sus inhibidores naturales, los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP).2, 5). Los fibroblastos, los constituyentes celulares primarios de la capa subepitelial, desempeñan un papel central en la fibrosis debido a sus propiedades biosintéticas, contráctiles y proinflamatorias.6). Bajo la influencia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), los fibroblastos se diferencian en miofibroblastos, que exhiben una activación persistente en el asma, lo que lleva a un depósito excesivo de ECM y progresión de la fibrosis.7,8,9).
La interleucina-5 (IL-5), una citocina clave tipo 2, se reconoce tradicionalmente por su papel en la maduración, activación y reclutamiento de eosinófilos en sitios de inflamación.9, 10). Sin embargo, la evidencia emergente sugiere que la IL-5 también puede influir directamente en las células estructurales de las vías respiratorias. Estudios recientes han identificado la expresión del receptor alfa de IL-5 (IL-5Rα) en células epiteliales y fibroblastos de las vías respiratorias, lo que implica a la IL-5 en procesos más allá de la inflamación mediada por eosinófilos.11, 12). A pesar de estos hallazgos, el papel directo de la IL-5 en la remodelación de las vías respiratorias, particularmente en la activación de fibroblastos y la fibrosis, sigue siendo poco comprendido.
Para evaluar esto más a fondo, investigamos los efectos directos de la IL-5 sobre la activación de los fibroblastos y la remodelación de la ECM, utilizando fibroblastos primarios de las vías respiratorias cultivados a partir de biopsias endobronquiales de pacientes con asma. Específicamente, hemos evaluado el impacto de la IL-5 en la proliferación de fibroblastos, el depósito de ECM, la expresión de MMP y TIMP y la secreción de citocinas. Nuestros hallazgos proporcionan conocimientos novedosos sobre el papel profibrótico de la IL-5 en el asma, destacando su contribución potencial a la remodelación de las vías respiratorias y sugiriendo nuevos objetivos terapéuticos y resultados para la intervención.
Materiales y métodos
Cultivo celular de fibroblastos.
En este estudio se utilizaron fibroblastos bronquiales primarios humanos, obtenidos de Lonza derivados de sujetos no fumadores con asma e individuos sanos. Las características de los sujetos utilizadas en este estudio se resumen en la (Tabla complementaria 1). Las células se mantuvieron en medio Eagle modificado de Gibco Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) (Cat: 10,565,018 Gibco-thermofisher) suplementado con 15 % de suero fetal bovino (FBS) (Sigma-Aldrich, Cat: F7524), 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco®) y/o crecimiento de fibroblastos. medio (FBM) de Lonza (Cat: CC-3132). Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C (Thermofisher) HERA cell 150i Carbon Dioxide Incubator) que contenía 5% de CO2 y 21% de oxígeno. Todos los experimentos se realizaron utilizando células en el paso 6 o antes.
Tratamiento celular
Los fibroblastos asmáticos y sanos se estimularon con interleucina 5 recombinante humana (hrIL-5) (I+D, Cat: 205-IL-025) usando 0,5 ng/ml para diferentes puntos de tiempo según la necesidad de cada experimento, incluidas 1 h, 6 h y 48 h. La concentración se eligió en función del trabajo anterior como en (11). Las células se privaron de alimento antes de la estimulación utilizando DMEM/F-12 (Cat: 10.565.018 Gibco-thermofisher suplementado con FBS al 0,01 % (Sigma Aldrich, Cat: F7524) y penicilina/estreptomicina al 1 % durante 24 h.
PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
Se sembraron fibroblastos sanos y asmáticos graves a 0,5 x 105 células/ml en placas de 6 pocillos hasta ~ 70% de confluencia. Luego, las células se recogieron y se lavaron con PBS enfriado con hielo para la extracción de ARN. La extracción de ARN se realizó utilizando Trizol (Cat: T9424, Sigma-Aldrich) siguiendo el protocolo del fabricante. Se sintetizó ADN complementario (ADNc) a partir de 1 µg de ARN total utilizando un kit de síntesis de ADNc de alta capacidad (Cat: 4.368.814, Thermofisher) según el protocolo del fabricante. La RT-PCR se realizó usando 100 ng/μl de ADNc, la amplificación se realizó usando 5 × Hot FirePol EvaGreen qRT-PCR SuperMix (Cat: 08–36-00001, Solis Biodyne), la amplificación se realizó usando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados se resumen en la Tabla 1. Los niveles de expresión de los genes probados se normalizaron a una expresión de 18 s y el cambio en veces se calculó como 2 − ΔΔct.
Tabla 1 que muestra las secuencias de cebadores que se utilizaron en el análisis qRT-PCRmesa de tamaño completo
mancha occidental
Se utilizaron lisados celulares de fibroblastos humanos derivados de sujetos sanos y asmáticos graves para evaluar los niveles de proteína necesarios. Las células se lisaron utilizando tampón RIPA enfriado con hielo (Cat: ab156034, Abcam) suplementado con tabletas inhibidoras de cóctel de proteasa (Sigma-Aldrich). Las concentraciones de proteína del lisado de células completas se cuantificaron utilizando el kit de cuantificación de proteínas BCA siguiendo las instrucciones del fabricante. Se separaron alícuotas de lisado que contenían 30 μg de proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio al 10% y al 12% (SDS-PAGE) transferidas a membranas de PVDF (Cat: 1,620,177, Bio-Rad) después de la activación con metanol al 100%. La membrana se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó con (1xTBST) y se hizo reaccionar con anticuerpos primarios resumidos en la Tabla 2. Las transferencias se sondaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C. Luego, la transferencia se incubó con anticuerpos secundarios (anti-ratón y anti-conejo) (Cat: 7076S y 7074S Cell Signaling Technology) en diluciones de 1:500 durante 1 h a temperatura ambiente. La quimioluminiscencia se detectó utilizando el kit ECL (Cat: 170–5060 BioRad). La cuantificación de la banda de proteínas se llevó a cabo utilizando el software Bio-Rad Image Lab (ChemiDoc™ Touch Gel y Western Blot Imaging System; Bio-Rad). Se utilizó tubulina y GAPDH como control de normalización y para garantizar una carga igual.
Tabla 2 Resumen de los anticuerpos primarios utilizados para la detección de proteínas.mesa de tamaño completo
Tinción intracelular
Se sembraron fibroblastos derivados de pulmones asmáticos graves y sanos a 2 x 105 en una placa de 6 pocillos, se dejaron que las células alcanzaran una confluencia del 70%, luego se dejaron pasar hambre durante la noche y luego se estimularon con 0,5 ng/ml de hrIL-5 durante 4 h. Brefeldin A (cat: 00–4506-51, Invitrogen), un bloqueador de la formación vesical para prevenir la secreción y el tráfico de proteínas, se añadió 1 h antes de finalizar el experimento, en una proporción de 1 μl por 1 ml de medio de cultivo. Las células se recogieron y se lavaron con PBS enfriado con hielo. Las células se tiñeron contra aloficocianina (APC) Anti-IL-6 humana (Cat: 501,112, Biolegend), Anticuerpo anti-TNF-α humano Alexa Fluor® 488 (Cat: 502,915, Biolegend) y Anticuerpo anti-LAP humano (TGF-β1) de ficoeritrina (PE) (Cat: 300,004, Biolegend). Los anticuerpos se diluyeron en tampón FACS de tinción a una dilución 1:100, las células se incubaron con la mezcla de anticuerpos durante 30 minutos a 4 °C manteniendo la oscuridad. Las muestras se procesaron con BD FACS Aria III (BD, EE. UU.) y se analizaron con el software FlowJo 10.0.
ELISA
Se sembraron fibroblastos sanos y asmáticos graves a 2 x 105 en una placa de 6 pocillos, se dejaron alcanzar una confluencia del 70%, luego se dejaron pasar hambre durante la noche, las células se trataron o no con hrIL-5, durante 4 h y 48 h, se recogió el sobrenadante del cultivo celular (medio) para fines de ELISA. Se utilizaron kits ELISA para detectar las siguientes proteínas secretadas: kit ELISA IL-6 humano (Cat: ab178013; límite de detección: 1,6 pg/mL), kit ELISA TGF-β1 humano (Cat: ab100647; límite de detección: 18 pg/mL), kit ELISA MMP-3 humano (Cat: ab269371; límite de detección:…
