Resumen
Fondo
Hígado quinasa B1 (Lkb1, nombre del gen Stk11) funciona como un supresor de tumores en el cáncer. La célula mieloide Lkb1 potencia la inflamación pulmonar inducida por el lipopolisacárido componente de la pared celular bacteriana Gram-negativa y en la defensa del huésped durante la neumonía Gram-negativa. Aquí, buscamos investigar el papel del mieloide Lkb1 en la inflamación pulmonar provocada por el ácido lipoteicoico (LTA) del componente de la pared celular bacteriana Gram-positiva y durante la neumonía causada por el patógeno respiratorio Gram-positivo. steotococos neumonia (Spneu).
Métodos
Macrófagos derivados de médula ósea y alveolares (AM, BMDM) extraídos de Lkb1 mieloide específico deficiente (Stk11-ΔM) y los ratones de control compañeros de camada fueron estimulados con LTA o Spneu in vitro. Stk11-ΔM y los ratones de control se desafiaron a través de las vías respiratorias con LTA o se infectaron con Spneu en vivo.
Resultados
Los AM y BMDM deficientes en Lkb1 produjeron menos factor de necrosis tumoral (TNF) α tras la activación por LTA o Spneu. Durante la inflamación pulmonar inducida por LTA, Stk11Los ratones -ΔM tenían un número reducido de AM en los pulmones, así como una liberación de citocinas y un reclutamiento de neutrófilos en las vías respiratorias disminuidos. Durante la neumonía inducida por encapsulados o no encapsulados Spneu, Stk11-ΔM y los ratones de control tenían cargas bacterianas y respuestas inflamatorias comparables en el pulmón, con la excepción de niveles más bajos de TNFα en Stk11-Ratones ΔM después de la infección con la cepa no encapsulada.
Conclusión
El mieloide Lkb1 contribuye a la inflamación pulmonar inducida por LTA, pero no es importante para la defensa del huésped durante la neumonía neumocócica.
Fondo
Las infecciones del tracto respiratorio inferior siguen estando entre las diez principales causas de mortalidad en todo el mundo [1]con steotococos neumonia (Spneu) que representa el patógeno bacteriano más común de la neumonía adquirida en la comunidad [2]. Cuando los neumococos ingresan al tracto respiratorio inferior, los macrófagos alveolares (MA) son los primeros en la línea para capturar las bacterias e iniciar una respuesta del huésped. [3]. Sin embargo, las cepas invasivas de estas bacterias Gram-positivas se caracterizan por tener una cápsula gruesa de polisacáridos que ayuda al organismo a invadir el pulmón y escapar del sistema inmunitario. [2]. Esto plantea el interés de estudiar la función de los AM durante la respuesta del huésped a Spneuexplorando nuevos objetivos potenciales para el tratamiento de la neumonía.
En los últimos años se ha hecho evidente que la quinasa hepática B1 (Lkb1) afecta el desempeño de los macrófagos durante la respuesta inmune. [4,5,6,7]. Lkb1, también conocida como serina/treonina quinasa 11 (STK11), desempeña un papel importante en muchos procesos celulares, como la proliferación y el desarrollo. [8,9,10]y metabolismo celular [11]. Se reconoció por primera vez como un gen supresor de tumores en el síndrome de Peutz-Jeghers. [12]y ahora se sabe que está involucrado en muchas otras neoplasias malignas [13]. En el campo de las respuestas inmunes a patógenos infecciosos, se ha descrito que Lkb1 tiene un efecto supresor sobre la actividad proinflamatoria de los macrófagos. [5, 7] y participar en la proliferación de AM [7]. Dos estudios recientes, incluido uno de nuestro grupo, informaron que la falta de Lkb1 en el linaje mieloide de ratones está asociada con un número reducido de AM [6, 7]que se acompañó de una defensa antibacteriana deteriorada durante la neumonía causada por Klebsiella (K.) pneumoniae [6] o Estafilococo (S.) aureus [7]. La deficiencia mieloide de Lkb1 resultó en una patología pulmonar exagerada durante S. aureuspero no durante Klebsiella neumonía [6, 7], lo que sugiere que el papel de esta proteína en la respuesta del huésped durante la infección del tracto respiratorio inferior depende, al menos en parte, del patógeno causante. A este respecto, es importante tener en cuenta que los ratones mieloides deficientes en Lkb1 demostraron una liberación de citoquinas fuertemente reducida en las vías respiratorias tras la administración intrapulmonar de lipopolisacárido (LPS), un componente principal de las bacterias Gram-negativas (incluyendo Klebsiella) y un potente agonista del receptor tipo Toll (TLR)4 [6].
Aquí, buscamos investigar el papel del mieloide Lkb1 en la inflamación pulmonar inducida por el componente de la pared bacteriana Gram-positiva y el ácido lipoteicoico (LTA) agonista de TLR2. [14] y viable Spneu. Para esto, utilizamos ratones deficientes en Lkb1 específicos de mieloide y modelos de ratón bien establecidos de un desafío LTA de las vías respiratorias y neumonía neumocócica. Nuestra investigación sugiere que Lkb1 juega un papel en la respuesta inflamatoria mediada por TLR2 de las células mieloides, pero que su función potencial se oscurece durante la infección respiratoria por neumococos viables.
Métodos
animales
Homocigoto Stk11fl/fl ratones (014143; Laboratorio Jackson, Bar Harbor, ME) [10] se cruzaron con LysMcrear ratones [15] para generar deficiencia de Lkb1 específica de células mieloides (Stk11-ΔM) ratones. Stk11fl/fl Se usaron compañeros de camada cre-negativos como controles en todos los experimentos. Todos los ratones modificados genéticamente se retrocruzaron al menos 6 veces con un fondo C57Bl/6 y se mantuvieron bajo cuidado estándar. Los ratones tenían la misma edad y sexo y se utilizaron en experimentos a las 8-12 semanas de edad. Los experimentos se realizaron de acuerdo con la Ley holandesa de experimentos con animales y fueron aprobados por la Comisión central de experimentos con animales.
Aislamiento y diferenciación de médula ósea
Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) se obtuvieron mediante la recolección de médula ósea de tibias y fémures de ratones ingenuos mediante lavado con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS; Invitrogen, Carlsbad, California). Los grumos se eliminaron dispersando las células usando una jeringa con una aguja 21G. Las células se centrifugaron a 1250 rpm durante 5 min a 4 °C. Las células se suspendieron en medio completo (RPMI 1640 con yo-glutamina y HEPES 25 mM; Gibco, Thermo Fisher, Waltham, MA) que contiene suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % complementado con medio condicionado con L929 al 15 % (como fuente de M-CSF; producido como se describe en [16]) y cultivadas a 37 °C y 5% CO2 para diferenciarse en BMDM. Después de 7 días de diferenciación, los BMDM adherentes se lavaron con PBS y se separaron con tripsina (Lonza, Basilea, Suiza). Las células se sembraron en placas de cultivo de fondo plano de 48 pocillos (Greiner Bio-one Frickenhausen, Alemania) a una densidad de aproximadamente 250.000 células por pocillo en medio completo y se dejaron adherir durante la noche.
Aislamiento de macrófagos alveolares
Los ratones ingenuos se anestesiaron con isoflurano y terminaron por dislocación cervical. Los AM se recogieron mediante lavado broncoalveolar (BAL) con PBS que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM. Las células se sembraron en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos (Greiner Bio-one Frickenhausen, Alemania) a una densidad de aproximadamente 40.000 células por pocillo en medio completo y se dejaron adherir durante la noche.
estimulación celular
Los BMDM y AM adherentes se lavaron con PBS y se estimularon durante 4 o 24 h con 10 µg/ml de LTA ultrapuro (de S. aureusInvivogen, San Diego, CA), muertos por calor Spneu 6303 (ATCC 6303, American Type Culture Collection, Manassas, VA) a una multiplicidad de infección (MOI) 10:1, una cepa mutante no encapsulada de Spneu D39 (mutante por deleción del locus de la cápsula isogénica (cps) D39Δcps) [17] MOI 100:1, o control medio. Después de la estimulación, el sobrenadante para las mediciones de citoquinas se almacenó a -20 °C y se analizó como se describe a continuación. La viabilidad de los BMDM se evaluó después de 24 h de estimulación en placas de 96 pocillos de polipropileno no adherente (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria). Las células se lavaron con PBS, se tiñeron con colorante de viabilidad fijable eFluor 780 (Invitrogen) y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe a continuación.
modelo de inflamación pulmonar
Se indujo inflamación pulmonar en ratones mediante la administración intranasal de 100 µg de LTA ultrapuro (S. aureusInvivogen, San Diego, CA) en 50 µl de solución salina normal como se describió anteriormente [18, 19]. Seis horas después de la instalación de LTA, los ratones se sacrificaron como se describe anteriormente y se realizó BAL con 5 × 500 µl de PBS estéril que contenía EDTA 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA). El fluido BAL (BALF) se almacenó a -20 °C hasta el análisis; Las células se analizaron por citometría de flujo. Los pulmones fueron digeridos como se describió antes. [6] y teñidos para análisis por flujo…
