Resumen
Antecedentes
En el asma, la señalización de los esteroides sexuales se reconoce como un regulador crítico de la fisiopatología de la enfermedad. Sin embargo, el papel paradójico de los esteroides sexuales, especialmente los estrógenos, sugiere que un mecanismo anterior o incluso independiente del estrógeno juega un papel importante en la regulación de la fisiopatología del asma. En este contexto, en nuestros estudios anteriores, exploramos la señalización de la kisspeptina (Kp) y su receptor Kiss1R en la regulación de la remodelación de las células del músculo liso de las vías respiratorias humanas in vitro y la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) in vivo en un modelo de ratón (tipo salvaje, WT) de asma. En este estudio, evaluamos el efecto de Kp endógeno en la regulación de AHR y la remodelación utilizando ratones knockout Kiss1R (Kiss1R-/-).
Métodos
Los ratones C57BL/6J WT (Kiss1R+/+) y Kiss1R-/-, tanto machos como hembras, fueron expuestos por vía intranasal a alérgenos mixtos (MA) y/o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Utilizamos el análisis flexiVent para evaluar la resistencia de las vías respiratorias (Rrs), la elastancia (Ers) y la distensibilidad (Crs). Después de esto, se realizó un lavado broncoalveolar (BAL) para el recuento diferencial de leucocitos (DLC) y el análisis de citoquinas. La tinción histológica se realizó utilizando hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis morfológico y tricrómico de Masson (MT) para la deposición de colágeno. Además, se procesaron secciones de pulmón para inmunofluorescencia (IF) de Ki-67, α-actina del músculo liso (α-SMA) y tenascina-c.
Resultados
Curiosamente, la pérdida de Kiss1R exacerbó la función pulmonar y la contractilidad de las vías respiratorias en ratones expuestos a MA, con efectos más profundos en ratones hembra Kiss1R-/-. Los ratones Kiss1R-/- desafiados con MA mostraron un aumento significativo en la infiltración de células inmunes y los niveles de citocinas proinflamatorias. Es importante destacar que la pérdida de Kiss1R agravó las citocinas sesgadas por Th2/Th17 en ratones desafiados con MA. Además, la histología de secciones de pulmón de ratones Kiss1R-/- mostró una mayor deposición de colágeno en las paredes de las vías respiratorias y producción de mucina en las células de las vías respiratorias en comparación con los ratones Kiss1R+/+. Además, el análisis de inmunofluorescencia mostró que la pérdida de Kiss1R agravó significativamente la remodelación de las vías respiratorias y, posteriormente, la AHR.
Conclusiones
Estos hallazgos demuestran la importancia de la señalización inherente de Kiss1R en la regulación de la inflamación de las vías respiratorias, la AHR y la remodelación en la fisiopatología del asma.
Fondo
El asma es una enfermedad inflamatoria crónica común de las vías respiratorias con diversos fenotipos clínicos e influencias genéticas y ambientales intrincadas.1, 2). Actualmente, más de 339 millones de personas padecen asma y se espera que la prevalencia del asma aumente un 50% cada década (3). Con los avances recientes, ahora tenemos una mejor comprensión de la fisiopatología de la enfermedad y de varios factores asociados que contribuyen a la gravedad y prevalencia del asma.4). A pesar de los tratamientos clínicos avanzados disponibles para controlar la inflamación y el estrechamiento agudo de las vías respiratorias, la incidencia de asma, incluido el asma grave, sigue aumentando.5, 6). Clínicamente, el asma se caracteriza por episodios de estrechamiento de las vías respiratorias y obstrucción del flujo aéreo, lo que conduce a una mayor mortalidad si no se controla.7,8,9). Las principales manifestaciones clínicas del asma grave incluyen hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR), inflamación, hiperplasia de células caliciformes y remodelación fibrótica de las vías respiratorias.10, 11). Aquí, explorar los mecanismos que influyen en los cambios estructurales en las vías respiratorias, y por lo tanto en la remodelación de las vías respiratorias y la AHR, es crucial dado que las terapias actualmente disponibles, incluidos los corticosteroides, son ineficaces para abordar estos aspectos de remodelación de la progresión del asma.12, 13).
Un aspecto reconocido del asma son las diferencias relacionadas con la edad y el sexo en la epidemiología y las manifestaciones clínicas. La prevalencia de asma en los niños prepúberes es mayor que en las niñas, pero esta tendencia se revierte después de la pubertad y las mujeres experimentan un aumento en la prevalencia del asma que luego disminuye con la menopausia.14, 15). Estos datos proporcionan evidencia del papel modulador de los esteroides sexuales, particularmente el estrógeno, en la regulación de la fisiopatología del asma.2, 9, 16). Sin embargo, aún no está claro si el estrógeno es protector o perjudicial en el asma, y algunos estudios muestran que los estrógenos aumentan la inflamación.17, 18), mientras que otros asocian los estrógenos con un papel mitigador del asma (19, 20). Este papel paradójico del estrógeno representa posibles mecanismos anteriores o independientes del estrógeno o, por el contrario, una pérdida de otras vías protectoras relevantes durante la progresión de la enfermedad. La kisspeptina (Kp) regula la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) y los esteroides gonadales, mientras que el estrógeno, a través del receptor de estrógeno α, regula negativamente las neuronas Kp en los núcleos arqueados hipotalámicos (ARC).21). Además, se observó que el número de neuronas Kp aumentaba en las mujeres después de la menopausia, pero disminuía después de la administración de estrógenos.22, 23). En consecuencia, exploramos Kp y su receptor Kiss1R, que están regulados negativamente por el estrógeno en el manejo de la fisiopatología del asma (10).
Kp es un producto del gen KiSS1, que se encuentra en el cromosoma 1q32.1 en humanos y 1E4 en ratones (24). Cuando el gen KiSS1 se transcribe y traduce, produce un precursor de 145 aminoácidos. Luego, este precursor se modifica proteolíticamente para crear un péptido de 54 aminoácidos amidado en el extremo C, así como varios fragmentos más cortos como kisspeptina-10, kisspeptina-13 y kisspeptina-14.25, 26). Todos estos péptidos más cortos contienen un elemento activo esencial de 10 aminoácidos y actúan como ligandos endógenos para la activación de KISS1R (10). Informes anteriores han demostrado que Kp a través de la activación de Kiss1R inhibe la metástasis de células cancerosas y desempeña un papel clave en la regulación de la pubertad (27). Estudios recientes de nuestro grupo han demostrado por primera vez la expresión de Kp y KISS1R en las vías respiratorias de los pulmones humanos, especialmente en las células del músculo liso de las vías respiratorias (ASM). Además, hemos observado una expresión disminuida de Kp y KISS1R en las vías respiratorias durante la condición asmática, lo que sugiere una pérdida de la señalización de Kp/KISS1R durante la progresión de la enfermedad. Además, nuestra investigación ha demostrado que la activación de KISS1R utilizando Kp-10 mitiga la proliferación inducida por PGDF en células ASM humanas mediante la inhibición de las vías de señalización ERK y P38/MAPK (26). Recientemente, también demostramos el efecto antimigratorio de KISS1R en células ASM humanas a través de un mecanismo dependiente de AMPc/PKA (28). Estos hallazgos in vitro fueron respaldados por un modelo de asma en ratones in vivo, donde encontramos que la activación de Kiss1R con un agonista específico, Kp-10 en ratones WT C57BL/6J alivió la AHR y la remodelación de las vías respiratorias (10). Además, estudios de otros grupos demostraron que la obesidad inducida por la dieta puede alterar la señalización de Kp/Kiss1R, lo que conduce a la acumulación de tejido adiposo en las vías respiratorias y da como resultado su remodelación.29). A excepción de estos estudios, hay informes muy limitados disponibles sobre el papel de Kp/Kiss1R en la regulación de la función y estructura de las vías respiratorias en modelos de asma en ratones.
En el presente estudio, utilizamos una nueva línea de ratones knockout para Kiss1R (Kiss1R-/-) generada con tecnología recombinante avanzada del genoma Cre/lox para determinar si la Kp secretada endógenamente regula la señalización de Kiss1R e influye en la fisiopatología del asma. Informes anteriores muestran que la alteración de la señalización de Kiss1R se asocia con el desarrollo espontáneo de obesidad y trastornos metabólicos, particularmente en ratones hembra.29, 30). Sin embargo, aún no se comprende completamente el impacto de la señalización intrínseca de Kiss1R en las funciones pulmonares y la remodelación de las vías respiratorias durante la progresión del asma. Por primera vez, intentamos explorar el mecanismo intrínseco de la señalización de Kp/Kiss1R en condiciones normales versus asmáticas utilizando ratones machos y hembras Kiss1R-/- y ratones Kiss1R+/+ como controles en un modelo murino inducido por alérgenos mixtos (MA). del asma. Nuestros resultados mostraron que los ratones Kiss1R -/- exhibieron una AHR y una remodelación exacerbadas en comparación con los ratones Kiss1R +/+ tras la exposición a MA. Curiosamente, en comparación entre ratones Kiss1R-/- machos y hembras, las hembras mostraron cambios más profundos en la estructura y funciones de las vías respiratorias en comparación con los machos.
Métodos
animales
Todos los protocolos de estudio con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Dakota del Norte y se llevaron a cabo siguiendo las pautas derivadas de la “Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio” (31). Los ratones Kiss1R knockout (Kiss1R-/-) C57BL/6 fueron generados por Jackson Laboratory, EE. UU., utilizando la línea celular KOMP ES Kiss1Rtm1(KOMP)Vlcg, RRID: MMRRC_057618-UCD. La línea celular se obtuvo del Centro de Investigación y Recursos de Ratones Mutantes (MMRRC) de la Universidad de California en Davis, un depósito de cepas financiado por los NIH y fue donada al MMRRC por David Valenzuela, George Yancopoulos, Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brevemente, en estos ratones, el alelo parental Kiss1Rrtm1(KOMP)Vlcg que contenía un casete de selección de neomicina se eliminó mediante escisión mediada por Cre y se reemplazó con un mutante Secuencia del receptor lacZ. La introducción y escisión del inserto KOMP interrumpe el primer exón y escinde el segundo al quinto exón de Kiss1R. Posteriormente, se realizó una reproducción interna utilizando ratones heterocigotos para obtener las crías. A las 3 semanas de edad, los ratones fueron genotipados mediante PCR de ADN genómico siguiendo el método descrito previamente (32). Los ratones fueron identificados por su genotipo de acuerdo con las bandas observadas en las imágenes del gel (Fig. 1B) y se separaron en Kiss1R+/+ (WT; control de compañeros de camada), Kiss1R+/− (heterocigotos) y Kiss1R−/− (homocigotos). Todos los ratones experimentales se alojaron en un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 con una temperatura mantenida entre 18 y 24 °C, y se les proporcionó comida y agua ad libitum. En este estudio se utilizaron ratones de ambos sexos con un mínimo de 6 a 8 ratones en cada grupo.
Esquema del modelo de asma en ratón alérgico inducido por alérgenos mixtos (MA). El genotipado se realizó a la edad de 3 semanas, y tanto los ratones machos como las hembras se agruparon como Kiss1R+/+ (WT) y Kiss1R-/-…
