Resumen
El síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARD) son las principales causas de mortalidad de pacientes críticos. El aclaramiento mediado por macrófagos deteriorados de las células apoptóticas (eferocitosis) en ARDS contribuye a la inflamación prolongada, sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. En este estudio, investigamos el papel de la geranilgeranil difosfato sintasa (GGPP) en la eferocitosis durante la resolución de lesiones pulmonares. Identificamos cambios dinámicos en la expresión de GGPPS en macrófagos pulmonares y monocitos circulantes a lo largo de las fases de progresión y resolución de la lesión pulmonar aguda (ALI). Los ratones Knockout específicos de mieloide exhibieron inflamación pulmonar prolongada, una mayor acumulación de neutrófilos apoptóticos, un mayor número de macrófagos reclutados y un número reducido de macrófagos residentes. En particular, los macrófagos reclutados juegan un papel dominante en la eferocitosis en comparación con los macrófagos residentes. La deficiencia de GGPPS suprimió la eferocitosis en subconjuntos de macrófagos in vivo e in vitro. Mecánicamente, la nocaut GGPPS interrumpió la señalización de AXL en los macrófagos reclutados. Es importante destacar que la administración de geranilgeraniol (GGOH) rescató la resolución retrasada de la lesión pulmonar, restauró la eferocitosis y aumentó la expresión de AXL suprimida en ratones CKO. Colectivamente, este estudio identifica los GGPP como un regulador clave de la eferocitosis mediada por AXL en los macrófagos reclutados, destacando su potencial como un objetivo terapéutico para acelerar la resolución de ARDS.
Nuevo y notable
La tasa de mortalidad de ALI/ARDS es alta, mientras que la elección terapéutica es limitada. Explorar el mecanismo de resolución de lesiones pulmonares es clave para identificar objetivos terapéuticos. Nuestros hallazgos mostraron un efecto beneficioso de los GGPP en la resolución de la lesión pulmonar. La eferocitosis mediada por AXL en los macrófagos reclutados podría ser el mecanismo clave.
Introducción
La lesión pulmonar aguda (ALI) y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARD) son causas principales de insuficiencia respiratoria aguda con alta mortalidad. A pesar de la extensa investigación sobre la patogénesis de ARDS, la terapia sigue siendo principalmente de apoyo (1). En la fase de resolución del SDRA, los neutrófilos infiltrados sufren apoptosis y posteriormente se fagocitan por macrófagos a través de un proceso conocido como eferocitosis (2, 3). La eferocitosis implica tres pasos principales: el reclutamiento de macrófagos, el reconocimiento y la unión de las células apoptóticas, y la posterior internalización y degradación de los objetivos (4,5,6). Un proceso de eferocitosis bien coordinado podría prevenir la liberación de sustancias neutrófilos nocivos y los macrófagos reprogramados hacia un fenotipo antiinflamatorio (2, 7, 8). En pacientes con SDRA y modelo de ratón Ali, se suprimió la eferocitosis (9, 10). En particular, la eferocitosis ineficiente se ha implicado en el aumento del daño pulmonar y los resultados más pobres de ALI/ARDS (10, 11), mientras que la eferocitosis mejorada podría acelerar la reparación de la lesión pulmonar (12). El mecanismo preciso por el cual se reguló la eferocitosis sigue siendo difícil de alcanzar.
La geranilgeranil difosfato sintasa (GGPP) en la vía de mevalonato es una enzima ramificada importante que convierte farnesil difosfato (FPP) en geranilgeranil difosfato (GGPP) (13). Los dos productos de isopreno no esteroideos aguas abajo, FPP y GGPP, involucran en la modificación prenilada de diferentes GTPasas. La expresión desregulada de GGPPS está involucrada en el desarrollo de diversas enfermedades, incluida la enfermedad del hígado graso (14), infertilidad (15) y diabetes (16). Anteriormente identificamos un papel de GGPP en la fase aguda del modelo de ratón Ali (17). Sin embargo, el papel de los GGPP en la eferocitosis y la resolución de la lesión pulmonar sigue siendo desconocido. Es de destacar que se ha informado que en el modelo de ratón de osteonecrosis relacionada con el bisfosfonato de la mandíbula, suplemento con geranilgeraniol (GGOH), un análogo de sustrato para GGPP, podría rescatar la eferocitosis de macrófagos y mejorar la curación ósea (18), indicando que los GGPP podrían desempeñar un papel en la eferocitosis. Para probar la hipótesis, se investigó el impacto de la deficiencia de GGPP en la eferocitosis de los macrófagos y la resolución de lesiones pulmonares. Dos poblaciones de macrófagos, macrófagos residentes y reclutados, coexisten en el pulmón inflamado con una programación transcripcional y funcional distinta (19). Por lo tanto, también se examinaron los efectos de la deficiencia de GGPP en el recuento y la capacidad eferocitótica de los dos subconjuntos de macrófagos. Este estudio identificó a los GGPP como un regulador positivo clave de la eferocitosis en los macrófagos reclutados y la resolución de ARDS.
Métodos
Ratones
Los ratones C57BL/6, WT (GGPPSFL/FL) y CKO (GGPPSFL/FLYSMCRE) se adquirieron en Gempharmatech Co., Ltd. Todos los experimentos de animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo China sobre el cuidado de los animales y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nanjing.
Modelo de ratón Ali
Para establecer el modelo de ratón Ali, los ratones (8-12 semanas, hombres) se anestesiaron con tribromoetanol (30 μl/g, Meilunbio, China) e inculcaron intratraqueal con LPS (Sigma, O55: B5, 0.5 mg/kg). En grupos separados de ratones, GGOH (Sigma, 25 mg/kg) fue inyectado intraperitonealmente el día 3 y el día 4 de Ali. Los ratones fueron sacrificados 0, 1, 3, 5 o 7 días después de la instilación de LPS. Los pulmones correctos eran lavados con solución salina. Las células de fluido de lavado broncoalveolar (BALF) se enumeraron en un contador de células automatizado (Bio-Rad) o se sometieron a análisis de citometría de flujo. O las muestras de citospinas de células BALF se tiñeron con Giemsa de Wright y se analizaron por microscopía óptica. Los pulmones izquierdos se cosecharon para el análisis histológico.
Análisis BALF
La concentración de proteína total se cuantificó utilizando el ensayo de proteína BCA (Beyotime, China). Los niveles de IL-6, TNF-α, IL-1β e IL-10 en BALF se midieron utilizando los kits ELISA (ServiceBio, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Histología, inmunotinción y anotación de lesiones pulmonares
Los pulmones izquierdos se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche seguido de incrustación de parafina y seccionamiento. Luego se tiñeron las rodajas con hematoxilina y eosina (H&E) o se sometieron a inmunofluorescencia como se describió anteriormente (20, 21). Todos los anticuerpos se enumeraron en la tabla complementaria S1. Ali fue anotado como se describió anteriormente (22).
Aislamiento de monocitos de sangre periférica
Los monocitos de sangre periférica de ratón se aislaron utilizando el kit de aislamiento de monocitos de sangre periférica de ratón (TBD2011M, Tianjin, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se usaron gránulos celulares para la extracción posterior de ARN y el análisis QRT-PCR.
Inducción de neutrófilos apoptóticos
Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión de Ética en el Hospital Jinling. La sangre periférica (6 ml, anticoagulada con EDTA) se adquirió de consentir voluntarios sanos (de 18 a 60 años). Los neutrófilos se aislaron utilizando Histopque-1077 (Sigma) e Histopaco-1119 (Sigma) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Luego, los neutrófilos aislados se expusieron a la irradiación UV (254 nm, UVS-26, bulbo 6-W, 0.02 J/s/cm2) a una concentración de 2.5 × 10^6 células/ml durante 15 minutos y se incubaron a 37 ℃ durante 2 h. Aproximadamente el 70% de los neutrófilos eran apoptóticos (anexina V+7-Aad- células) (Fig. 1 complementaria).
Manchas de tunel
La tinción de etiquetado de extremo de nick de desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) del tejido pulmonar del ratón en el día 5 de ALI se realizó utilizando el kit de ensayo TUNEL (ServiceBio, China) siguiendo los protocolos del fabricante. Las imágenes se capturaron utilizando microscopía fluorescente y se analizaron utilizando el software Image J (National Institutes of Health, EE. UU.).
Ensayo de eferocitosis in vivo
La capacidad eferocitótica también se evaluó como el porcentaje de células LY6G+ dentro de los macrófagos, según lo determinado por el análisis de citometría de flujo. La eferocitosis también se analizó después de la instilación intratraqueal (IT) con neutrófilos apoptóticos. Los neutrófilos apoptóticos se marcaron con CFSE (Invitrogen) y luego inculcó en ratones WT o CKO (1.0 × 10^7 en 100 μl por ratón). 3 h después, las células BALF se cosecharon y analizaron por citometría de flujo. La capacidad eferocitótica se presentó como el porcentaje de células CFSE+ dentro de los macrófagos F4/80+ (23).
Ensayo de eferocitosis in vitro
Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDMS) y los macrófagos alveolares (AM) se generaron como se describió anteriormente (17). BMDMS o AMS (5 × 104 células por pozo) se superponen con neutrófilos apoptóticos (macrófagos: neutrófilos = 1: 5–1: 10) marcados con CFSE (Invitrogen, 0.5 μm) durante 2 h. Luego, BMDMS o AMS envolviendo neutrófilos apoptóticos se analizaron por citometría de flujo (los porcentajes de CFSE+ en células F4/80+). La estrategia de activación se mostró en la figura complementaria 2. La eferocitosis in vitro también se evaluó mediante análisis de inmunofluorescencia. Los BMDM marcados con CMTPX (Invitrogen) se convocaron con neutrófilos apoptóticos marcados con CESE. 2 h Más tarde, la eferocitosis se cuantificó como el porcentaje de células CMTPX+ CESE+. Para el pretratamiento con inhibidor de GGOH o AXL, los BMDMS se trataron con GGOH (10 μM, Sigma) 24 h o con R428 (2.5 μm, Selleck) 1 h antes de la coincubación, respectivamente.
Citometría de flujo
Brevemente, las células se bloquearon con reactivo de bloqueo FCR (Miltenyi, Alemania) durante 10 minutos, y luego se inmunotinaron con anticuerpos primarios. Para analizar epítopos derivados de neutrófilos apoptóticos dentro de los macrófagos, las células BALF se bloquearon y se tiñeron con el tinte de viabilidad (ThermoFisher), F4/80, CD11b y CD11c, seguido de la fijación con la solución BD Cytofix/Cytoper (BD BIOSCIENSES) y la PERMEBILIZACIÓN Utilizando 1 × BD Perm/Buffer (BISCIENS (BISOSCIENS (BISCIENCIAS). Finalmente, las células se tiñeron con LY6G. La relación de las células LY6G+ en los macrófagos se determinó como el nivel de eferocitótico (24, 25). Los datos se adquirieron en citometría de flujo (MoFlox XDP, Beckman) y se analizaron con el software Flow Jo (Tree Star, EE. UU.). Todos los anticuerpos se enumeraron en la tabla complementaria S1.
Mancha occidental
La extracción de proteínas y la evaluación de la concentración de proteína se realizaron como se describió anteriormente (22). Las proteínas se cargaron en geles SDS-PAGE, se transfirieron a las membranas de PVDF (Millipore, EE. UU.), Se incubaron con anticuerpos y reaccionó …
(Tagstotranslate) Síndrome de dificultad respiratoria aguda
