Resumen
El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es un subtipo de cáncer de pulmón altamente prevalente con un pronóstico insatisfactorio, que requiere nuevas dianas terapéuticas. Las proteínas SUMO similares a la ubiquitina modifican covalentemente los sustratos y sus propiedades funcionales. Aquí informamos que SAE1 regula la señalización de p53 a través de su capacidad para SUMOilar p53 y diseccionar los modificadores ascendentes de SAE1. Los niveles basales de SAE1 estaban elevados en las células de NSCLC, especialmente en las líneas de adenocarcinoma de pulmón A549 y carcinoma de células escamosas PC-10. Para sondear la función de SAE1, utilizamos ARN lentivirales en forma de horquilla corta para desactivar de forma estable SAE1 en células A549 y PC-10. La eliminación de SAE1 impidió significativamente la invasión inmune en NSCLC in vitro e in vivo y promovió la detención del ciclo celular de las células de NSCLC in vitro. Mecánicamente, la eliminación de SAE1 suprimió la exportación nuclear de p53 y la SUMOilación, mientras que la proteína 184 con dedos de zinc (ZNF184) con metilación anormalmente reducida en NSCLC aumentó la transcripción de SAE1. En particular, el silenciamiento de p53 rescató la evasión inmune impedida por la caída de SAE1, y la sobreexpresión de SAE1 también rescató los beneficios antitumorales de sh-ZNF184. En general, este estudio aclara que la metilación anormalmente reducida de ZNF184 media la activación transcripcional de SAE1 e impide la expresión de p53 a través de SUMOilación, gobernando así la detención del ciclo celular y promoviendo la evasión inmune en la progresión del NSCLC.
Introducción
El cáncer de pulmón es el segundo tipo de cáncer más común y mortal en todo el mundo, y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es el subtipo más común de cáncer de pulmón (1). El NSCLC, incluido el adenocarcinoma de pulmón humano (LUAD), el carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) y el carcinoma de células grandes, se desarrolla a partir de la exposición a carcinógenos que impulsan cambios genéticos y epigenéticos complejos que contribuyen a la desregulación de las vías de señalización relacionadas con el control del ciclo celular y la evasión inmune, lo que resulta en una proliferación celular descontrolada y progresión tumoral.2). El deterioro de la vigilancia inmune juega un papel fundamental en todas las etapas de la tumorigénesis, que surge cuando las células tumorales evaden la vigilancia inmune, lo que finalmente permite que las células proliferen y metastaticen.3). Por lo tanto, es fundamental obtener una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares que rigen la regulación del ciclo celular del NSCLC y la evasión inmune, ya que este conocimiento puede revelar nuevos objetivos y estrategias terapéuticas.
La pequeña modificación mediada por modificador similar a la ubiquitina (SUMOilación) es una modificación postraduccional crítica que desempeña una variedad de funciones biológicas, que incluyen, entre otras, la regulación transcripcional, la estabilidad de las proteínas y la progresión del ciclo celular.4, 5). La SUMOilación es catalizada por una cascada de enzimas similar a la de la ubiquitinación de proteínas, en la que la glicina C-terminal de SUMO y Cys173 de UBA2 forman un enlace tioéster bajo la guía de la enzima activadora de SUMO SAE, un heterodímero compuesto de SAE1 y UBA2 (6, 7). Por ejemplo, la sobreexpresión de SAE1 indujo la SUMOilación y la fosforilación de Ser473 de AKT, lo que promovió el crecimiento de células de glioma in vitro e in vivo (8). Curiosamente, SAE1 estaba regulado positivamente en el NSCLC y su eliminación restringió el crecimiento del NSCLC (9). Aunque la inhibición de la SUMOilación se ha relacionado con un mayor reclutamiento de células inmunes antitumorales en el colangiocarcinoma (10), no se ha revelado el papel regulador de SAE1 en la evasión inmune en NSCLC.
Un objetivo de la SUMOilación es el supresor de tumores p53, que frecuentemente se inactiva en los cánceres, y se ha demostrado que la SUMOilación de p53 inhibe su actividad transcripcional.11). Además, se ha descubierto que SAE1 interactúa directamente con p53, promoviendo su modificación SUMO (12). La proteína p53 es un factor de transcripción que puede activar la expresión de varios objetivos, participando así en la modulación del ciclo celular, la apoptosis y la estabilidad genómica.13). Además, p53 puede regular positivamente la expresión de moléculas MHC de clase I para mejorar el papel de las células T CD8+.14). Se ha pensado que las células T citotóxicas CD8+ activadas por inmunoterapia eliminaban principalmente las células tumorales a través de la vía citotóxica perforina/granzima.15). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la SUMOilación de p53 mediada por SAE1 puede ser un mecanismo que promueve la progresión del ciclo celular del NSCLC y la evasión inmune mediada por células T CD8+. Probar esta hipótesis podría proporcionar nuevos conocimientos importantes sobre cómo la regulación postraduccional por SAE1 permite la supervivencia de las células de NSCLC y la evasión inmune.
Métodos y materiales.
Pacientes y muestras de tejido.
Se recolectaron muestras de tejido tumoral y no tumoral emparejado de 42 pacientes con NSCLC sometidos a tratamiento quirúrgico en el Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Harbin desde marzo de 2022 hasta enero de 2025, y ninguno de los pacientes recibió radioterapia o quimioterapia preoperatoria. Los datos clínico-patológicos se resumen en la tabla. 1. La presente investigación recibió la aprobación del Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Harbin y se ajustó a la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.
Tabla 1 Características clínico-patológicas de 42 pacientes con NSCLCmesa de tamaño completocultivo celular
Células epiteliales bronquiales humanas (HBE135-E6E7; CL-0732, Procell, Wuhan, Hubei, China), líneas celulares de NSCLC humano con subtipo LUAD (A549; iCell-h011, EIAab, Wuhan, Hubei, China y PC-9, CL-0668, Procell), células LUSC humanas HCC-1588 (HTX2642) y PC-10 (HTX3509, ambos de Otwo Biotech, Shenzhen, Guangdong, China), y células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) de ratón (iCell-m027, Cellverse, Shanghai, China) se aplicaron en este estudio. Las células A549 se sembraron y cultivaron en Ham’s F-12 K que contenía 10 % de FBS + 1 % de penicilina/estreptomicina, PC-9 en medio RPMI-1640 y células HBE135-E6E7, HCC-1588, PC-10 y LLC en DMEM, que se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2.
Las células A549, PC-10, HCC-1588 y LLC se infectaron utilizando lentivirus de ARN de horquilla corta (sh) -SAE1, sh-ZNF184, oe-SAE1, sh-p53, control negativo de sh (NC) u oe-NC. Todos los lentivirus eran de OriGene (Beijing, China). Las células estables finalmente se examinaron utilizando 2,5 µg/ml de puromicina para experimentos posteriores. Las células A549 y PC-10 se trataron con un inhibidor de la metilación del ADN 6 µM 5-azacitidina (5-aza) (99,91%, HY-10586, MedChemExpress, Monmouth Junction, Nueva Jersey, EE. UU.) o el DMSO de control en un medio de crecimiento celular durante 4 h.
RT-qPCR
El ARN total de las células se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (15596026CN, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.), seguido de la síntesis de ADNc de primera cadena utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript IV (18091050, Invitrogen). La RT-qPCR se realizó en un amplificador genético cuantitativo en tiempo real TurboQ (Blue-Ray Biotech Corp., Taiwán, China) utilizando el kit One Step PrimeScript RT-PCR (RR064B, Takara Bio Inc., Tokio, Japón) con GAPDH como gen de referencia. Las secuencias de cebadores de los genes correspondientes se enumeran en la tabla 2. La expresión relativa de genes relacionados se analizó mediante el método 2−ΔΔCt.
Tabla 2 Secuencias de cebadores para RT-qPCRmesa de tamaño completoTransferencia Western (WB)
La proteína total se extrajo de células NSCLC (A549, PC-10 y HCC-1588) o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) después del cocultivo utilizando un ensayo de radioinmunoprecipitación, lisis y tampón de extracción (89901, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), y las proteínas totales extraídas se mezclaron con una carga concentrada de proteína 2X SDS-PAGE. tampón y se calienta en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos para desnaturalizar completamente las proteínas. Después de que las proteínas desnaturalizadas se enfriaron a temperatura ambiente, las muestras de proteínas se cargaron en los pocillos del gel SDS-PAGE y se transfirieron a la membrana de difluoruro de polivinilideno. Inmediatamente después de la transferencia de la membrana, la membrana proteica se enjuagó con tampón de lavado Western (10X) (P0023C3, Beyotime, Shanghai, China) durante 2 minutos y se selló con albúmina sérica bovina (BSA) durante la noche a 4 °C. El ensayo WB se realizó utilizando los anticuerpos primarios contra ZNF184 (1:1000, MBS9400600, MyBioSource, Inc., San Diego, CA, EE. UU.), SAE1 (1:2000, GTX113602, GeneTex, Inc., Alton Pkwy Irvine, CA, EE. UU.), p53 (1:1000, GTX638291, GeneTex), Perforin (1:1000, ab256453, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.) y Granzyme B (GzmB) (1:1000, ab134933, Abcam) a 4 °C durante la noche. Posteriormente, se añadió un anticuerpo secundario: IgG anti-conejo de cabra H&L (HRP) (1:20000, ab6721, Abcam) y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Se utilizó el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico PLUS (34580, Thermo Scientific), seguido de imágenes de exposición y registro. Anti-GAPDH (1:1000, ab9485, Abcam) sirvió como control de carga.
Cocultivo de células NSCLC con PBMC
Se cultivaron PBMC humanas (932027, NovoBiotechnology Co., Ltd., Beijing, China) en medio RPMI-1640 y se activaron durante 1 semana con Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 para la expansión y activación de células T (11161D, Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.) (16). Se sembraron células A549, PC-10 y HCC-1588 en placas de 24 pocillos con una densidad de aproximadamente 5 × 104 hasta que la confluencia alcanzó el 70% -80%. Posteriormente, se sembraron PBMC humanas en el sistema de cocultivo con células NSCLC en una proporción celular de 5:1 y se incubaron durante 48 h. Una vez completada la incubación, el medio se recogió directamente debido a las propiedades adherentes de las células A549, PC-10 y HCC-1588. Se realizó una centrifugación para eliminar los restos celulares del medio y se recogió el sobrenadante. Alternativamente, se realizó otra centrifugación para precipitar PBMC para los siguientes experimentos.
ELISA
Los niveles de IFN-γ y TNF-α en el sobrenadante del sistema de cocultivo se midieron utilizando el kit ELISA de alta sensibilidad de IFN-γ humano (ab236895, Abcam) y el kit ELISA de TNF-α humano (ab100654, Abcam).
Separación nucleoplásmica y ensayo de WB.
Las células A549 y PC-10 se lisaron utilizando el reactivo de extracción citoplasmática y núcleo NE-PER (78833, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los lisados se centrifugaron a la velocidad más alta durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recogió como fracción citoplasmática. El pellet se resuspendió en…
