Resumen
Antecedentes
El epitelio de las vías respiratorias es un componente importante de la estructura de las vías respiratorias y el iniciador de la remodelación de las vías respiratorias en el asma. Los cambios de la matriz extracelular (MEC), como la deposición de colágeno y la alteración estructural, son características patológicas típicas de la remodelación de las vías respiratorias. Por lo tanto, la identificación de mediadores clave que se derivan del epitelio de las vías respiratorias y que son capaces de modular la MEC puede proporcionar información valiosa para la terapia dirigida del asma.
Métodos
Se analizaron los conjuntos de datos de la base de datos Gene Expression Omnibus para examinar los genes expresados de forma diferencial en el epitelio de las vías respiratorias del asma. Recolectamos biopsias broncoscópicas y muestras de suero de sujetos asmáticos y sanos para evaluar la expresión de la enzima tipo 2 de la lisiloxidasa (LOXL2). Se realizó la secuenciación de ARN y varios experimentos para determinar las influencias de la supresión de LOXL2 en modelos de ratón inducidos por ovoalbúmina (OVA). Se exploraron los roles y mecanismos de LOXL2 en las células epiteliales bronquiales utilizando ARN interferente pequeño de LOXL2, plásmido de sobreexpresión e inhibidor de AKT.
Resultados
Tanto el análisis bioinformático como otros experimentos revelaron que LOXL2 se expresa en gran medida en el epitelio de las vías respiratorias de los asmáticos. In vivo, la supresión de LOXL2 inhibió significativamente la deposición de matriz extracelular inducida por OVA y la transición epitelial-mesenquimal (EMT) en ratones. In vitro, los experimentos de transfección en células 16HBE demostraron que la sobreexpresión de LOXL2 aumenta la expresión de N-cadherina y fibronectina y reduce la expresión de E-cadherina. Por el contrario, después de silenciar LOXL2, la expresión de E-cadherina se regula al alza. Además, el proceso de remodelación y EMT inducido por el factor de crecimiento transformante β1 podría mejorarse y debilitarse después de la sobreexpresión y el silenciamiento de LOXL2 en células 16HBE. Combinando la secuenciación de ARN de tejidos pulmonares de ratón y experimentos in vitro, LOXL2 estuvo involucrado en la regulación de la vía de señalización de AKT. Además, el tratamiento con inhibidor de AKT in vitro alivió parcialmente las consecuencias asociadas con la sobreexpresión de LOXL2.
Conclusiones
En conjunto, los resultados demostraron que la LOXL2 epitelial desempeña un papel en la remodelación de las vías respiratorias asmáticas, en parte a través de la vía de señalización AKT, y destacaron el potencial de la LOXL2 como objetivo terapéutico para la remodelación de las vías respiratorias en el asma.
Fondo
El asma es una enfermedad crónica común de las vías respiratorias que afecta entre el 1 y el 29% de la población en diferentes países (1, 2). Se caracteriza por síntomas paroxísticos de sibilancia, opresión en el pecho, dificultad para respirar y tos, junto con una limitación variable del flujo de aire espiratorio (3). En la actualidad, la mayoría de los asmáticos pueden controlarse bien con el uso racional de corticosteroides, broncodilatadores y fármacos biológicos (4). Sin embargo, debido a la mala respuesta a los tratamientos anteriores, algunos pacientes tienen episodios recurrentes y finalmente desarrollan una limitación persistente del flujo aéreo (4, 5). La remodelación de las vías respiratorias, también conocida como cambios estructurales de las vías respiratorias que incluyen acumulación de matriz extracelular (MEC), hiperplasia del músculo liso y fibrosis subepitelial, es una de las principales causas de limitación persistente del flujo de aire en los asmáticos (3, 5). Por lo tanto, es necesario identificar objetivos potenciales que puedan retrasar o inhibir el desarrollo de la remodelación de las vías respiratorias.
La matriz extracelular (ECM) es una red intrincada compuesta por componentes estructurales y no estructurales derivados de diferentes células, como células epiteliales, células musculares lisas y fibroblastos (6, 7). La deposición, la desorganización y la rigidez de la matriz extracelular son características patológicas importantes de la remodelación tisular, que pueden afectar el fenotipo y la función de las células residentes en formas de mecanotransducción y señalización de afuera hacia adentro (8, 9). En consecuencia, un número cada vez mayor de investigadores presta atención a los mediadores capaces de modular la matriz extracelular y a los beneficios de las terapias dirigidas en modelos de enfermedades.
La lisil oxidasa tipo 2 (LOXL2), un miembro de la familia de la lisil oxidasa, desempeña un papel fundamental en la catálisis de la reticulación de la elastina y el colágeno, lo cual es esencial para la homeostasis de la matriz extracelular (ECM).10Se informa que los estímulos mecánicos, la inflamación y la hipoxia pueden inducir la regulación positiva de LOXL2 (11,12,13) y, como consecuencia, se agrava el proceso patológico de fibrosis o remodelación en diversas enfermedades, como insuficiencia cardíaca, cáncer, hipertensión arterial pulmonar y fibrosis de órganos (por ejemplo, hígado, pulmón y riñón).11, 14,15,dieciséis,17,18). Por ejemplo, Yang et al. encontraron que las áreas con fibrosis intersticial profunda de los pacientes con insuficiencia cardíaca siempre están acompañadas de una alta expresión de LOXL2, y cuyo nivel está estrechamente asociado con la disfunción diastólica (11). Posteriormente, se demostró que LOXL2 aumentó significativamente en varios modelos animales fibróticos y promovió la activación de fibroblastos y miofibroblastos, que a su vez produjeron más ECM (9, dieciséis,17,18). Los inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen selectivamente a LOXL2 han demostrado un efecto considerable en la inhibición de la progresión de la fibrosis (dieciséis, 18, 19). Recientemente, Ramis et al. observaron que el nivel de LOXL2 en las células del músculo liso de las vías respiratorias (ASM) y los haces de músculo liso aumentaban drásticamente en los asmáticos y la supresión de LOXL2 podría reducir la rigidez de la matriz extracelular y el grosor del ASM (20). Cabe destacar que el epitelio de las vías respiratorias es el iniciador de la remodelación de las vías respiratorias en el asma, en el que el nivel de expresión de LOXL2 también está significativamente elevado según los análisis de los archivos de expresión de ARN de la base de datos de Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Por lo tanto, una mayor exploración de la relación y los mecanismos potenciales entre LOXL2 y el asma puede proporcionar información significativa para desarrollar tratamientos prometedores.
Materiales y métodos
Identificación de genes expresados diferencialmente (GED)
Identificamos los conjuntos de datos de GSE179156 y GSE40374 de la base de datos GEO. En GSE179156, la secuenciación del transcriptoma del epitelio bronquial de controles sanos (n = 29) y asmáticos sin tratamiento (n = 38) se analizó con GEO2R para obtener los DEG (basados en |Fold change|≥1,5 y valor P < 0,05). Mientras tanto, se realizó el mismo análisis en células M-BE tratadas con o sin factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) en GSE40374. La lista de 1026 genes relacionados con la matriz extracelular se descargó de la base de datos de firmas moleculares (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb), Archivo adicional 1: Tabla S1. La base de datos STRING (https://www.string-db.org/) se utilizó para analizar la interacción de genes superpuestos. Posteriormente, el resultado se importó al software Cytoscape para identificar los DEG clave.
Sujetos y muestreo de muestras
Pacientes con asma diagnosticados según la Iniciativa Global para el Asma (actualizada en 2022) y controles sanos fueron reclutados en la clínica respiratoria del hospital local. Se recogieron los datos clínicos y muestras de sangre venosa en ayunas de 5 ml de todos los participantes. Después de centrifugar los tubos procoagulantes que contenían muestras de sangre a 3000 rpm durante 15 minutos, absorbimos el sobrenadante y los almacenamos inmediatamente a -80 °C. Las muestras epiteliales bronquiales de los pacientes con asma se obtuvieron mediante biopsia broncoscópica, mientras que los sujetos con sospecha de lesiones intraaéreas pero sin hallazgos patológicos anormales proporcionaron las muestras de biopsia normales. Las características clínicas de los sujetos que donaron las muestras epiteliales bronquiales se muestran en el archivo adicional 1: Tabla S2. Todos los sujetos de este estudio fueron informados del propósito del estudio y firmaron el consentimiento por escrito.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Se utilizó el kit ELISA comercial (EK1391; Boster, Wuhan, China) para medir el nivel de LOXL2 en suero. El procedimiento experimental se llevó a cabo cuidadosamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cultivo y tratamiento de células
Las células epiteliales bronquiales humanas (16HBE) se adquirieron en Fuheng Biotechnology (Shanghai, China) y se cultivaron en un medio de queratinocitos (KM; ScienCell, Carlsbad, CA, EE. UU.) suplementado con un 1 % de suplemento de crecimiento de queratinocitos (KGS; ScienCell). Las células se incubaron a 37 °C con un contenido de dióxido de carbono del 5 %. La proteína TGF-β1 humana (PRP100190, Abbkine, Wuhan, China) se utilizó para estimular las células 16HBE a diferentes concentraciones y puntos temporales. Para investigar la función y el mecanismo de LOXL2, transfectamos células 16HBE con un vector de control o un vector de sobreexpresión de LOXL2 (GenePharma, Shanghai, China), un control negativo de ARN interferente pequeño (siRNA) o siRNA de LOXL2 (GenePharma, Shanghai, China) utilizando EndoFectinTM-Max (GeneCopoeia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de ARNi de LOXL2 son las siguientes:
siRNA-1:5'-GGGCAGAAGAGGAAGCACATTUGUGCUUCCUCUUCUGCCCTT-3';
siRNA-2:5'-AGAUAGAGAACCUGAAUAUTTAUAUUCAGGUUCUCUAUCUTT-3';
ARNip-3: 5'-AGGUGCUGGUGGAGAGAAATTUUUCUCUCCCACCAGCACCUTT-3'.
Después de los experimentos de transfección de plásmidos, las células 16HBE también fueron tratadas con un inhibidor de AKT (MK2206, Selleck, EE. UU.) para explorar el mecanismo potencial de LOXL2.
Construcción de modelos animales y protocolos
Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 que pesaban alrededor de 20 g a las 7-8 semanas de PengYue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, China). Para establecer los modelos de asma crónica, se trató a los ratones en dos etapas. Primero, se los sensibilizó mediante inyección intraperitoneal de solución de ovoalbúmina (OVA) (20 ug en 200 μL de solución salina tamponada con fosfato; Sigma-Aldrich) mezclada con Al(OH)3 (2 mg) los días 0, 7 y 14. Luego, se expuso a los ratones inhalando aerosol de OVA al 3 % en días alternos desde el día 21 hasta el 58. El ARN de horquilla corta (shRNA) LOXL2 empaquetado con lentivirus (LV) o el shRNA de control negativo (LV-shNC) se inyectaron en los ratones a través de la vena de la cola. Basándonos en el estudio previo de nuestro equipo, se inyectó el lentivirus a ratones en tres dosis separadas entre los días 21 y 58. En consecuencia, dividimos a los ratones en 4 grupos (6 ratones en cada grupo): 1) grupo LV2-shNC; 2) grupo LV2-shLOXL2; 3) grupo OVA+LV2-shNC; 4) grupo OVA+LV2-shLOXL2. En referencia al estudio previo de nuestro equipo, se midió la resistencia de las vías respiratorias de los ratones bajo la estimulación de metacolina utilizando flexiVent (Scireq).
