Resumen
Antecedentes
Las terapias de modulación altamente efectivas (HEMT) recientemente aprobadas han cambiado la vida de las personas con FQ. Aunque estos fármacos han dado lugar a mejoras significativas en la función pulmonar y la tasa de exacerbaciones, no se han erradicado las poblaciones bacterianas del pulmón. Los mecanismos detrás de la continua colonización no están del todo claros.
Métodos
Utilizamos una rata humanizada para evaluar los efectos del tratamiento con ivacaftor sobre los resultados de la infección. Las ratas albergan un inserto que expresa ADNc de CFTR humanizado, incluida la mutación G551D. Se trataron ratas hG551D con ivacaftor durante o antes de la infección con P. aeruginosa. La respuesta a la infección se evaluó mediante la carga bacteriana en el pulmón y la carga mucosa en el pulmón.
Resultados
Descubrimos que las ratas hG551D tratadas con ivacaftor tenían una cantidad reducida de bacterias presentes en el pulmón en la fase aguda de la infección, pero no eran diferentes del control del vehículo en la fase crónica de la infección. De manera similar, el porcentaje de neutrófilos en las vías respiratorias se redujo en los momentos agudos, pero no en los crónicos. Los datos de peso general indicaron que las ratas hG551D tuvieron una recuperación de peso significativamente mejor durante el curso de la infección cuando fueron tratadas con ivacaftor. La potenciación de la mutación G551D con ivacaftor da como resultado mediciones de corriente de cortocircuito iguales a WT, incluso durante la fase crónica de la infección. A pesar de la infección persistente, las ratas hG551D tratadas con ivacaftor tuvieron menos tapones mucosos en las vías respiratorias durante la infección crónica.
Conclusiones
Los datos indican que las ratas hG551D tienen mejores resultados durante la infección cuando se tratan con ivacaftor en comparación con el grupo del vehículo. Las ratas aumentaron de peso, aumentaron la función de la proteína CFTR y disminuyeron la acumulación de moco, a pesar de la persistencia de la infección y la inflamación. Estos datos sugieren que ivacaftor mejora la tolerancia a la infección, en lugar de la erradicación, en este modelo de rata.
Introducción
En 2011, la FDA aprobó la primera molécula terapéutica dirigida al defecto básico de la fibrosis quística (1). Ivacaftor potencia la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), al mejorar la activación de la mutación G551D (2, 3). Desde entonces, ha sido aprobado para otras mutaciones y se ha combinado con moléculas pequeñas para corregir el defecto de plegamiento de proteínas que ocurre con mutaciones como F508del (4,5,6,7,8). Estos medicamentos ahora han llegado a una porción significativa de la población de pacientes en los Estados Unidos y Europa, y han producido cambios dramáticos en la salud general y la calidad de vida de aquellos que son elegibles (9,10,11,12). En conjunto, estos medicamentos se han denominado terapias moduladoras altamente efectivas, o HEMT, y se ha demostrado en la clínica que mejoran el cloruro en el sudor (13, 14), función pulmonar (15), aclaramiento mucociliar (16), estado nutricional (17), y para reducir las exacerbaciones pulmonares (18).
Los primeros datos del estudio GOAL, que recopiló datos sobre sujetos con tratamiento con ivacaftor durante hasta un año después del inicio, indicaron resultados iniciales prometedores en cuanto a resultados infecciosos (19). Específicamente, el estudio GOAL encontró que ivacaftor causa una reducción en la incidencia de infección por Pseudomonas aeruginosa, a los pocos meses del inicio del tratamiento, aunque la mayoría de los demás patógenos se mantuvieron sin cambios. Sin embargo, los datos de seguimiento y los estudios que lo corroboran en Europa indicaron que estos cambios fueron de corta duración (20). El conjunto de datos PROMISE publicado recientemente también mostró signos prometedores de reducción de las exacerbaciones en sujetos elegibles para Trikafta (12), pero también encontraron que la infección persistía en gran medida en el pulmón. No está claro por qué las bacterias permanecen ni qué impacto tendrán las infecciones futuras en la salud de los pacientes (11).
Para abordar estas preguntas en un modelo animal de FQ más controlable, creamos un modelo de rata humanizada que expresa CFTR con una mutación G551D (21). Anteriormente hemos demostrado que este modelo responde a ivacaftor con aproximadamente el 50 % de la función de WT CFTR, que ivacaftor es capaz de restaurar el transporte mucociliar y la hidratación de las vías respiratorias, y también que ivacaftor restaura de forma incompleta los resultados inflamatorios cuando se desafía al animal a imitar una exacerbación. (22). En este estudio, ampliamos la evaluación de ivacaftor para comprender cómo la restauración de los resultados de CFTR altera la infección.
El modelo hG551D de FQ replica tanto el fenotipo de infección muco-obstructiva como el de infección crónica observado previamente en modelos de ratas con FQ (23,24,25), que representa más fielmente la enfermedad pulmonar de sujetos humanos. Esta rata también ofrece un modelo proxy para la restauración de CFTR por cualquier medio, lo que permite formular preguntas sobre el alcance de la actividad de CFTR necesaria para corregir aspectos específicos de la fisiopatología. Este es un método que se ha utilizado en otros modelos animales (26, 27), y nos permite comprender la relación entre la mucosidad de las vías respiratorias, la infección por P. aeruginosa y la actividad de CFTR.
En el estudio presentado aquí, examinamos los efectos de ivacaftor en el tratamiento o la prevención de la infección por P. aeruginosa, cómo ivacaftor afectó la acumulación de moco después de la infección y cómo cambió la potenciación de CFTR durante la infección, para comprender los efectos moleculares de la terapia con ivacaftor. durante la infección pulmonar aguda y crónica.
Materiales y métodos
Modelo de rata con FQ
Los experimentos se realizaron utilizando la cepa humanizada-G551D-CFTR (21) ya sea G551D homocigoto (denominado hG551D) o sus controles de camada sin el inserto G551D (denominado WT). Esta cepa fue criada y genotipada como se describió anteriormente (28). Se emparejaron machos y hembras heterocigotos (CFTR hG551D/+) para generar crías WT y hG551D, como se indicó anteriormente. Todos los animales fueron criados y alojados en jaulas estándar mantenidas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a alimento y agua, en temperaturas que oscilaron entre 71 y 75 °F. Los animales hG551D y WT se mantuvieron con una dieta estándar para roedores con DietGel 76A suplementario (clear H20, Westbrook, ME, Estados Unidos) y una combinación de PEG3350 (Spectrum Chemical, New Brunswick, Nueva Jersey, Estados Unidos), Pedialyte Advanced Care Plus Powder ( Abbott, Abbot Park, IL, Estados Unidos) y benzoato de sodio (Sigma-Aldrich) añadidos al agua del destete, como medio para Reducir la mortalidad por obstrucción gastrointestinal. Los estudios se realizaron a los 6 meses de edad. Los grupos se dividieron lo más equitativamente posible entre hombres y mujeres.
Administración farmacológica
A las ratas WT y hG551D se les administró ivacaftor, obtenido de Selleckchem (Houston, TX, Estados Unidos), y suspendido en metilcelulosa. Ivacaftor se mezcló con metilcelulosa no más de 3 días antes de la administración y se almacenó a 4 °C. Los experimentos siguieron diferentes esquemas de administración, pero todos los animales recibieron ivacaftor a una dosis de 30 mg/kg/día o un vehículo de metilcelulosa al 3% mediante sonda oral.
Pseudomonas aeruginosa
Las ratas fueron infectadas con la cepa mucoide P. aeruginosa PAM57-15, un aislado clínico utilizado previamente (24, 29). Las bacterias se cultivaron en caldo de soja tríptico (TSB) hasta una absorbancia de 1,0 a 1,5 a 600 nm y se lavaron en PBS, pH 7. Las bacterias se incluyeron en agarosa utilizando métodos previamente establecidos y se ajustaron a una concentración de 1 × 106 UFC/ml. Para mantener la reproducibilidad, las preparaciones de perlas de agarosa se consideraron aceptables si la concentración de UFC, el volumen de las perlas por mililitro y el tamaño de las perlas eran todos consistentes.
Infección
Se administraron perlas de agarosa cargadas de P. aeruginosa a una concentración de 1 × 106 UFC/ml, mediante administración orotraqueal. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano y suspendidas en un soporte de intubación (Braintree Scientific) por sus incisivos. La lengua se sacó y se apartó utilizando unas pinzas romas y una jeringa unida a un extremo Luer romo de calibre 18 (Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA, EE. UU.) que se insertó más allá de la lengua y dentro de la tráquea para asegurar su llegada al pulmón. Se administraron 300 µl de perlas mediante una jeringa para un inóculo de 3 × 106 UFC, seguido de 50 µl de aire. Las ratas permanecieron erguidas en el soporte de intubación durante ≥ 5 s para completar la inhalación del inóculo y luego se les permitió recuperarse. Las ratas se pesaron antes de que comenzara el experimento (día 0) y diariamente hasta el sacrificio durante la duración del estudio.
Lavado broncoalveolar
Las ratas fueron sacrificadas mediante inyección intraperitoneal de 500 µl de pentobarbital sódico (390 mg/ml). Las ratas fueron desangradas, se expuso la cavidad torácica y se intubaron las vías respiratorias a través de la tráquea inferior. Se introducen 5 ml de PBS frío y estéril en los pulmones y se recogen en una jeringa estéril separada utilizando una llave de paso de dos vías. Se centrifugó líquido de lavado broncoalveolar (BALF) a 1200 rpm durante 7 minutos y se transfirió el sobrenadante para análisis de mucina. Las células sedimentadas se resuspendieron en PBS y se citocentrifugaron en portaobjetos a 500 xg durante 5 minutos. Los portaobjetos se fijaron y tiñeron con Diff-Quik (Siemens, Erlanger, Alemania). Los leucocitos se contaron manualmente y se identificaron visualmente.
UFC
Los pulmones se homogeneizaron mecánicamente en 5 ml de medio F-12 (Gibco, Thermofisher Scientific, Grand Island, NY, EE. UU.) y alícuotas de 200 μl diluidas en serie en TSB para el recuento manual en agar de aislamiento de Pseudomonas (Millipore Sigma, St. Louis, MO, EE.UU).
Histología
Las tráqueas y los pulmones se fijaron por inmersión en formalina tamponada con fosfato al 10% y se incluyeron en bloques de parafina para su corte, como se realizó anteriormente (28). Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) o azul alcian con ácido periódico de Schiff (ABPAS).
Análisis de mucina
Muc5b y Muc5ac se detectaron en membranas de nitrocelulosa utilizando métodos de transferencia puntual modificados (25) y anticuerpos selectivos para cada mucina (Muc5b ab87376 Abcam, Cambridge, MA, Estados Unidos; Muc5ac 10112-334, VWR, Radnor, PA, Estados Unidos), como se realizó anteriormente (24). La señal se detectó con anticuerpos secundarios HRP y el sustrato de máxima sensibilidad Femto SuperSignal West (Thermofisher Scientific, Grand Island, NY, Estados Unidos)….
