Evaluación de muestras respiratorias en diagnóstico de etiología y caracterización de microbiomas por secuenciación metagenómica

Resumen

Fondo

La aplicación de mNGS clínica para el diagnóstico de infecciones respiratorias mejora el diagnóstico de etiología; sin embargo, al mismo tiempo, presenta nuevos desafíos como método de secuenciación imparcial que informa todos los microbiomas identificados en la muestra.

Métodos

Se realizó una evaluación de estrategias y un análisis metagenómico para los datos de mNGS generados entre marzo de 2017 y octubre de 2019. Se evaluaron las fortalezas diagnósticas de cuatro tipos de muestras para identificar el tipo más apropiado para el diagnóstico de mNGS de infecciones respiratorias. La complejidad del microbioma se reveló entre las cohortes de pacientes y los tipos de infección. Se construyó una canalización bioinformática que se asemeja a los resultados del diagnóstico en función de múltiples parámetros bioinformáticos.

Resultados

Los valores predictivos positivos (VPP) para el diagnóstico de mNGS de no micobacterias, Micobacterias no tuberculosas (NTM), y Aspergilo fueron obviamente más altos en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF), lo que demuestra la potencia de BALF en el diagnóstico de mNGS. Los tejidos pulmonares y el esputo fueron aceptables para el diagnóstico de la Tuberculosis micobacteriana (MTB) infecciones. Curiosamente, se identificaron diferencias taxonómicas significativas en suficientes muestras BALF, y se encontraron composiciones únicas de bacterioma y viroma en las muestras BALF de pacientes con tumores. Nuestra tubería mostró fuerza diagnóstica comparativa con el diagnóstico microbiológico clínico.

Conclusiones

Para lograr un resultado de diagnóstico de mNGS confiable, se recomiendan muestras BALF para infecciones comunes sospechosas y tejidos pulmonares y esputo para infecciones dudosas de MTB para evitar los resultados falsos que brindan los microbiomas respiratorios complejados. Nuestra tubería bioinformática desarrollada con éxito ayuda a la interpretación de datos mNGS y reduce las correcciones manuales para el diagnóstico de etiología.

Fondo

La infección del tracto respiratorio (ITR) cubre una amplia gama de síntomas y puede causar millones de muertes en todo el mundo [1]. Aunque las listas de patógenos comunes (como steotococos neumonia, estafilococo aureus, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzaey anaerobios) como causantes de neumonía típica, prácticamente, un espectro más amplio de microorganismos puede infectar el sistema respiratorio humano y causar ITR inesperada, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. [2].

Recientemente, se desarrolló la secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS) y muestra su superioridad en términos de detección microbiana imparcial para las ITR. [3, 4]. La práctica clínica puede beneficiarse de las pruebas de mNGS respiratoria principalmente por los siguientes aspectos: (1) detección de patógenos inesperados como hongos raros en la neumonía crónica [5](2) identificación rápida de patógenos exigentes, como clamidia psittacien neumonía aguda y grave apoyando la terminación de la administración innecesaria de antibióticos de amplio espectro [6], (3) identificación rápida de patógenos de crecimiento lento como las micobacterias y mejora del efecto de las precauciones clínicas para prevenir la transmisión de la tuberculosis; (4) identificación de virus clínicamente no cultivables que permitan mejorar los programas de administración de antimicrobianos; (5) detección integral de múltiples patógenos en neumonía en inmunocomprometidos [7](6) detección de patógenos oportunistas antes del tratamiento no antimicrobiano (p.ejinhalación de glucocorticoides), y descartar infección en enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias [8]. Nuestro estudio anterior, centrado principalmente en las infecciones pulmonares, ha demostrado que, en los casos en los que el resultado de la identificación microbiana de los métodos convencionales no fue concluyente, la mNGS dio lugar al 61 % de los casos de modificaciones del diagnóstico y al 58 % de los casos de ajustes del tratamiento. [9]. Además, en comparación con el método de cultivo convencional, la sensibilidad de mNGS se ve menos afectada por la exposición a antibióticos. [10]. Todas las ventajas anteriores son clínicamente importantes para el diagnóstico de enfermedades respiratorias complicadas.

Sin embargo, la salida de los datos de mNGS es como una caja de Pandora, que consiste en una complejidad de microorganismos. La etiología a menudo se mezcla con contaminantes y colonizadores clínicamente insignificantes, lo que presenta desafíos para la interpretación general de los datos. Además, las vías respiratorias, uno de los sitios más complejos del cuerpo humano, no es un compartimento corporal estéril y alberga variedades de microbios específicos del sitio en huéspedes de condiciones de salud y enfermedades. [11]. Por lo tanto, el microbioma del tracto respiratorio contiene tanto comensales como patógenos, lo que dificulta el diagnóstico diferencial. Como tal, distinguir los patógenos legítimos del microbioma normal es el desafío central del diagnóstico de ITR basado en mNGS. Por otra parte, se deben realizar estudios que integren la detección de patógenos y la caracterización del microbioma por mNGS para impulsar la comprensión de las enfermedades respiratorias. [2,3,4]. Solo unos pocos estudios informan caracterizaciones de microbiomas basadas en mNGS [12, 13]. Siguen existiendo limitaciones para comprender el espectro detectado de bacterioma, viroma y micobioma de diferentes muestras de las vías respiratorias en enfermedades respiratorias [14]. Además, el microbioma respiratorio de pacientes con diferentes estados inmunitarios no se ha caracterizado por completo, aunque se sabe que los pacientes trasplantados tienen una mayor diversidad de viroma, con virus patógenos y no patógenos coexistiendo en un alto grado. [15]. Se supone que el microbioma afecta de manera desproporcionada a las poblaciones con diferentes estados inmunitarios.

Por otro lado, múltiples tipos de muestras respiratorias [nasopharyngeal aspirate, oropharyngeal swab, sputum, bronchoalveolar lavage fluid (BALF), pleural effusion, biopsy lung tissue, etc.] representan diferentes condiciones de las vías respiratorias, que exigen diferentes estándares de interpretación de datos mNGS [16]. Nuestro estudio anterior revela que la elección adecuada de muestras respiratorias y la interpretación de datos basada en tipos de patógenos de bacterias comunes (no micobacterias), micobacterias y hongos pueden reforzar la interpretación de datos de mNGS [9]. Además, los umbrales asociados a la bioinformática deben implementarse cuidadosamente para diferentes tipos de muestras para diferenciar los organismos identificados en agentes etiológicos, patógenos potenciales, contaminantes y/o comensales. [17]. En general, vale la pena pensar profundamente al elegir los tipos de muestras adecuados y desarrollar los estándares de interpretación de datos mNGS para el diagnóstico de RTI. [18].

Sobre la base de las lagunas de investigación anteriores, este estudio se llevó a cabo para comparar los valores de diagnóstico de mNGS utilizando cuatro tipos de muestras respiratorias y caracterizar las composiciones del microbioma respiratorio en función del tipo de muestra más adecuado. Además, se implementaron estándares específicos de muestras y tipos de patógenos para la interpretación de datos de mNGS y se evaluó la viabilidad de la tubería de interpretación de datos basada en umbrales.

Métodos

Inscripción de pacientes y diseño del estudio

Se recopilaron retrospectivamente un total de 1592 datos de mNGS de las vías respiratorias desde marzo de 2017 hasta octubre de 2019 en el Hospital Zhongshan, Shanghái, China. Después de la selección de datos a través de la revisión de gráficos y la verificación de registros, finalmente se inscribió una suma de 1261 muestras respiratorias de 943 pacientes para el siguiente análisis. Los registros de diagnóstico se obtuvieron al alta del paciente y se consideraron como la referencia contra la cual se compararon los resultados de mNGS. El diagnóstico se realizó de manera integral de acuerdo con los criterios clínicos y microbiológicos estándar para el diagnóstico de ITR en función de los síntomas de los pacientes y los resultados de las pruebas de laboratorio de microbiología de cultivo, examen patológico, pruebas de serología y reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La información del diagnóstico también fue la base para los tratamientos médicos del paciente y, por lo tanto, se utilizó como estándar de referencia.

El diseño del estudio se muestra en el diagrama de flujo de la Fig. 1. Brevemente, los pacientes fueron clasificados en tres grupos: a) RTI-C+M, enfermedad infecciosa clínicamente diagnosticada con evidencia microbiológica; b) RTI-C, enfermedad infecciosa diagnosticada clínicamente sin evidencia microbiológica, c)…

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