El antagonista de LPAR1, Pipe-791 produce efectos antifibróticos en modelos de fibrosis pulmonar.

Resumen

Antecedentes

La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una forma progresiva crónica de enfermedad pulmonar intersticial (ILD) caracterizada por una deposición de matriz extracelular significativa, daño alveolar y remodelación tisular. Los antagonistas contra el receptor acoplado a la proteína G, el receptor de ácido lisofosfatídico 1 (LPAR1) han demostrado eficacia en la fibrosis pulmonar preclínica y clínicamente. Aquí, perfilamos Pipe-791, una molécula pequeña, antagonista del receptor LPAR1 biodisponible oralmente, y mostramos su efectividad en varios contextos relacionados con la fibrosis pulmonar.

Métodos

In vitro, utilizamos fibroblastos pulmonares humanos y rodajas pulmonares cortadas de precisión (PCL) derivadas de donantes con fibrosis pulmonar para probar la eficacia de la tubería-791 en los marcadores reductores de fibrosis. In vivo, utilizamos modelos de fibrosis pulmonar inducidos por bleomicina para demostrar la eficacia de la tubería-791.

Resultados

Pipe in vitro-791 redujo la expresión de colágeno inducida por LPA (IC50 1.1 nm) en fibroblastos pulmonares humanos. También mostramos que LPAR1 está elevado en el tejido pulmonar IPF y que la tubería-791 redujo significativamente varios marcadores de fibrosis pulmonar en PCL medidas por la expresión génica y biomarcadores secretados. Usando la ocupación del receptor in vivo, encontramos que Pipe-791 tiene una larga cinética de asociación que resulta en un aumento de 20 veces en la potencia cuando se dosificó 3 versus 24 h antes de la administración del radioligando. A 3 mg/kg, la tubería-791 fue efectiva para reducir significativamente marcadores de fibrosis y expresión de colágeno en modelos de bleomicina de ratón.

Conclusiones

Mostramos que la pipa-791 reduce efectivamente la fibrosis y los marcadores fibróticos in vitro e in vivo y que tiene una lenta cinética de asociación y disociación. En conjunto, nuestros datos respaldan las pruebas clínicas de Pipe-791 en el contexto de afecciones fibróticas como IPF.

Introducción

La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una forma crónica y progresiva de enfermedad pulmonar intersticial (ILD) caracterizada por cantidades exageradas de matriz extracelular, daño alveolar y remodelación de tejido (1, 2). Estos conducen a una disfunción pulmonar significativa, una calidad de vida deteriorada y una supervivencia acortada. A nivel celular, la FPI es el resultado de la curación aberrante de la herida después de la lesión alveolar. En respuesta, los miofibroblastos producen un exceso de tejido cicatricial, lo que resulta en cambios dramáticos y perjudiciales en la estructura y función del pulmón. El estándar actual de atención para IPF incluye dos farmacoterapias, pirfenidona y nintedanib. Si bien se clasifica como antifibrótico, se desconoce el mecanismo de acción de perfenidona. Nintedanib, un inhibidor de la pan-tirosina quinasa, bloquea la activación de miofibroblastos que conduce a la fibrosis (3).

La señalización de ácido lisofosfatídico aberrante (LPA) a través de LPAR1 está vinculada a la etiología de la IPF (4,5,6). LPA se deriva de la conversión de lisofosfatidilcolina por autotaxina y normalmente sirve para promover la curación de heridas. Específicamente, la activación mediada por LPA de LPAR1 y su señalización posterior contribuyen a la inflamación y los mecanismos fibróticos. En contextos de enfermedades como IPF, los pacientes exhiben niveles elevados de LPA en el líquido de lavado broncoalveolar que conduce a una activación anormal de LPAR1 (5). Como resultado, la inhibición de LPAR1 ha generado un interés sustancial como objetivo para abordar las enfermedades fibróticas.

LPAR1 es un receptor acoplado a la proteína G que pertenece a una familia de receptores LPA de seis miembros, cada uno asociado con varios mecanismos de señalización a veces superpuestos. Estos efectos incluyen proliferación y diferenciación celular, regulación del citoesqueleto, quimiotaxis, inflamación y adhesión celular, muchos de los cuales han demostrado contribuir a la fibrosis (7). LPAR1 se expresa en numerosos tipos de células, incluidos macrófagos y fibroblastos (8,9,10). Tras la activación, LPAR1 induce inflamación y fibrosis en varios tejidos, incluyendo pulmón, hígado y riñón. Después de la lesión (p. Ej., Bleomicina), aumentan los niveles de LPA, activando LPAR1, promoviendo un estado profibrótico (5). Específicamente, la activación de LPAR1 aumenta la acumulación de componentes de matriz extracelular (ECM), señalización inflamatoria a través de NF-κB y quinasa N-terminal C-Jun, y la expresión de quimiocinas y citocinas inflamatorias, como la interleucina-6 (IL-6) (IL-6) (6).

Existe una gran evidencia que respalda el antagonismo LPAR1 para tratar varias fibrosas de órganos, incluido el pulmón. Como tal, perfilamos Pipe-791, un antagonista selectivo de LPAR1 de molécula potente y con una cinética farmacológica exclusivamente favorable, en varios contextos de fibrosis pulmonar. Mostramos que Pipe-791 mitiga la quimiotaxis y la producción de colágeno (dos características destacadas en la etiología de la FPI) en fibroblastos pulmonares humanos primarios cultivados. También mostramos que los niveles de proteína LPAR1 están elevados en el pulmón de la FPI y, utilizando cultivos de corte pulmonar de precisión (PCL) de donantes con fibrosis pulmonar (PF), muestran que la tubería-791 reduce varios marcadores fibróticos clave según lo evaluado por la expresión génica y los biomarcadores secretados de fibrogénesis y remodelación pulmonar. Para evaluar la ocupación in vivo del receptor pulmonar, desarrollamos un radioligando LPAR1 (3H) -PIPE-497 y mostramos desplazamiento dependiente de la dosis después de la administración oral de Pipe-791. Es importante destacar que observamos cobertura del receptor de 24 horas después de una sola dosis oral. Funcionalmente, la pipa-791 inhibe dependiendo la dosis una respuesta de histamina inducida por LPA en la sangre, un efecto que persiste 24 h después de una sola administración oral, correspondiente a la ocupación prolongada del receptor LPAR1. Utilizando esta información para guiar la selección y la frecuencia de la dosis, mostramos que Pipe-791 es efectiva tanto profiláctica como terapéuticamente para reducir el colágeno pulmonar en los modelos de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina. Por último, mostramos que Pipe-791 reduce la liberación de IL-1β en los macrófagos alveolares humanos y de roedores, destacando un posible papel para los macrófagos alveolares en la etiología de la fibrosis pulmonar.

Resultados

Pipe-791 es selectivo para LPAR1 humano1

Pipe-791 es un antagonista de LPAR1 que exhibe una cinética de asociación y disociación lenta distinta con poca actividad fuera del objetivo. Anteriormente habíamos evaluado la selectividad contra LPAR2 y 3 (11). Para obtener una visión adicional de la selectividad del receptor LPA, probamos y comparamos la potencia de Pipe-791 con LPAR2-6, esforzándose por maximizar la equivalencia biológica entre los receptores utilizando el mismo tipo de célula, el método de sobreexpresión y el punto final funcional. Los plásmidos LPAR1-6 humanos se transfectaron transitoriamente en células HEK293T y el EC80 (concentración efectiva que produce un efecto máximo del 80%) para la activación de LPA determinada empíricamente. Luego se probó la selectividad en un paradigma de respuesta de concentración utilizando una preincubación de 3 h seguida de movilización de calcio inducida por LPA. En este ensayo, Pipe-791 tenía un IC50 funcional de 8 nm, y pliegue la selectividad contra LPA2 a 6 de 58x, 50x, 76x, 14x y 101x, respectivamente (tabla 1).

Tabla 1 Tipe-791 Selectividad contra LPA 2–6Mesa de tamaño completo

Los antagonistas LPAR1 de generación anterior han sufrido la inhibición fuera del objetivo de la bomba de exportación de sal biliar (BSEP), lo que puede provocar toxicidad hepatobiliar (12). Cuando se analizó para la actividad contra BSEP, Pipe-791 mostró una inhibición mínima, con un IC50 de 24.4 µM, 3000 veces más alto que su LPAR1 IC50. Utilizando un ensayo de hepatocitos humanos cultivados en sándwich que contiene transportadores de eflujo que funcionan para evaluar la lesión hepática general y colestática (ensayo de lesiones hepáticas inducidas por fármacos colestáticos o C-DILI), 30 µM de tubería-791 no mostró un aumento de lactato de lactato-dehidrogenasa (un indicador de la muerte celular), ni una disminución en el contenido de ATP (un contenido de ATP (un contenido de ATP (una medición de células apreciables en la medición de la célula S1, una medición de células. la presencia o ausencia de una concentración tóxica de ácidos biliares.

Pipe-791 inhibe la producción de quimiotaxis y colágeno en fibroblastos pulmonares humanos primarios

Durante la fibrosis pulmonar, los fibroblastos activados migran al sitio de lesiones donde producen y secretan componentes de ECM, como el colágeno. Se ha demostrado que ambos fenómenos están inhibidos por otros antagonistas de moléculas pequeñas LPAR1 o en ratones knockout LPAR1 (4, 5). Intentamos verificar el impacto de la antagonización de LPAR1 con Pipe-791 en la quimiotaxis de fibroblastos pulmonares y la producción de colágeno in vitro. Los fibroblastos pulmonares humanos adultos primarios se incubaron con Pipe-791 y se agregaron a una placa de cámara de quimiotaxis usando LPA como quimioatrayente (Fig. 1A). Observamos que Pipe-791 inhibió la quimiotaxis de fibroblastos a un IC50 1.5 nm (Fig. 1B). Para inducir la producción de colágeno, los fibroblastos se incubaron con Pipe-791 y luego se agregaron LPA para inducir la diferenciación de fibroblastos y se evaluó la expresión de Col1a1 por inmunocitoquímica. Pipe-791 inhibió Col1A1 a un IC50 de 1.1 nm (Fig. 1C y D). En este ensayo, un antagonista LPAR1 de molécula pequeña diferente, BMS-986278 inhibió la expresión de colágeno con una potencia de 30.6 nm (Supp Fig. 2). Estos datos de quimiotaxis y colágeno están en buen acuerdo entre sí y son consistentes con los datos anteriores de fibroblastos humanos (11).

Fig. 1

Pipe-791 inhibe la expresión de colágeno y la quimiotaxis en fibroblastos pulmonares humanos adultos primarios. A. Diagrama que describe el ensayo de quimiotaxis: los fibroblastos pulmonares humanos se incuban con Pipe-791 y se colocan en placas en un inserto de cultivo transwell con LPA en la cámara de fondo como quimioatrayente. Los fibroblastos migran a través de los poros y a lo largo de la superficie inferior. Las células en la superficie inferior están separadas, lisadas y el lisado analizado para determinar el contenido de ADN con DAPI. B. Inhibición dependiente de la concentración de la quimiotaxis inducida por LPA medida por fluorescencia DAPI (A520 nM). Pipe-791 inhibe la quimiotaxis en un IC50 de 1.5 nm (n = 3, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001, ANOVA unidireccional, barras de error SEM). do. Inhibición dependiente de la concentración de la expresión de COL1A1 inducida por LPA en fibroblastos. Pipe-791 inhibe la inducción de COL1A1 con un IC50 de 1.1 nm (n = 3, ** p <0.01, *** p <0.001, *** p <0.0001, ANOVA unidireccional, Newman-Keuls, Barras de error SEM). D. Imágenes representativas de fibroblastos pulmonares humanos primarios tratados con vehículo, LPA o Pipe-791 y LPA y manchados para Col1a1 (verde) y hoechst (azul). Cada micrografía es de 100 µm de ancho

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Pipe-791 inhibe la transformación de miofibroblastos

Activación de fibroblastos por TGFβ1 o LPA …

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