Resumen
Antecedentes
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias caracterizada por enfisema y bronquitis crónica y una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo. La EPOC se asocia comúnmente con varias enfermedades comórbidas que contribuyen a exacerbar los resultados de los pacientes. El humo del cigarrillo (CS) es el factor de riesgo más destacado para el desarrollo y la progresión de la EPOC y se sabe que es perjudicial para numerosas funciones efectoras de las células inmunitarias residentes en los pulmones, incluida la fagocitosis y la producción de citocinas. Sin embargo, aún se desconoce cómo el CS media en las diversas patologías distantes del pulmón en la EPOC y si el CS tiene un efecto biológico similar sobre las células inmunes sistémicas.
Métodos
Se expusieron ratones C57BL/6 a 8 semanas de CS como modelo experimental de EPOC. Se aislaron células de la médula ósea de ratones de control expuestos a CS y de aire ambiente (RA) y se diferenciaron en macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM). Se aislaron macrófagos del espacio aéreo (AM) de los mismos ratones expuestos a CS y RA y se realizó RNA-Seq en masa. El papel funcional de los genes expresados diferencialmente se evaluó mediante análisis de ontología genética. Se utilizó el análisis de vías de ingenio para determinar los estados de activación de las vías canónicas y los reguladores ascendentes enriquecidos en genes expresados diferencialmente en ambos tipos de células, y para comparar las diferencias entre los dos tipos de células.
Resultados
CS indujo cambios transcriptómicos en BMDM, incluida una regulación positiva de genes en las vías de señalización de sirtuinas y fosforilación oxidativa y una regulación negativa de genes implicados en la metilación de histonas y lisina. Por el contrario, la CS indujo una disminución de la expresión de genes implicados en la respuesta a patógenos, la formación de fagosomas y el tráfico de células inmunitarias en los AM. Se observó poca superposición en los genes codificadores de proteínas expresados diferencialmente en los BMDM en comparación con los AM y sus vías asociadas, lo que destaca los distintos efectos del CS en las células inmunes en diferentes compartimentos.
Conclusiones
La exposición a CS puede inducir una remodelación transcriptómica en los BMDM que es distinta a la de los AM. Nuestro estudio destaca la capacidad de la exposición al CS para afectar las poblaciones de células inmunitarias distales al pulmón y justifica una mayor investigación sobre los efectos funcionales de estos cambios y el papel consiguiente en la conducción de enfermedades multimórbidas.
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria debilitante de las vías respiratorias y una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial. La EPOC es más que una simple enfermedad respiratoria y a menudo se asocia con múltiples comorbilidades con factores de riesgo superpuestos (“multimorbilidad”), que pueden interactuar de tal manera que exacerban los resultados clínicos.1,2,3,4,5). La inhalación de humo de cigarrillo (CS) es el principal factor de riesgo de EPOC, pero aún no está claro cómo el CS provoca las manifestaciones extrapulmonares de la EPOC.6,7,8,9,10,11,12).
El efecto biológico del CS sobre las poblaciones de células inmunes, en particular los macrófagos, puede ser un mecanismo por el cual el humo ejerce sus efectos sistémicos persistentes. CS provoca un aumento en el número de macrófagos en los espacios aéreos y el parénquima del pulmón, así como en otros órganos.12,13,14,15,16). Estos macrófagos, denominados macrófagos del espacio aéreo (MA), son una combinación de poblaciones residentes y reclutadas derivadas de monocitos (MDM) que están funcional y metabólicamente deterioradas en la EPOC y contribuyen directamente al desarrollo de enfisema.17,18,19,20,21,22,23). Los MDM reclutados en los pulmones al fumar tienen una quimiotaxis mejorada, son más proinflamatorios y con el tiempo pueden asumir la identidad de los AM a través de señales proporcionadas por el nicho pulmonar local.22, 24,25,26). No está claro si los MDM son “preparados” o alterados transcripcionalmente por el humo antes de su reclutamiento en el pulmón (27, 28). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de fumadores y personas con EPOC también son disfuncionales y más proinflamatorias que las de controles sanos.23, 29). Sin embargo, existe poca superposición transcriptómica entre las poblaciones de macrófagos pulmonares y PBMC de los mismos individuos y poca superposición en los marcadores inflamatorios entre la sangre y el esputo de individuos con EPOC, lo que sugiere que la inflamación sistémica en la EPOC puede ocurrir en paralelo y ser distinta de la misma. , inflamación pulmonar local (30,31,32,33). Nuestra hipótesis es que, antes de su entrada al pulmón, existe un efecto específico del compartimento del CS en la médula ósea y los MDM posteriores que prepara a estos macrófagos y los dirige hacia un estado inflamatorio alterado. Para probar esta hipótesis, investigamos las diferencias transcriptómicas en macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) y AM aislados de modelos murinos de EPOC expuestos al humo. Mostramos que el transcriptoma de poblaciones de macrófagos distantes está desregulado por el humo del cigarrillo, un efecto distinto del de los macrófagos del espacio aéreo. Nuestros resultados resaltan la desregulación sistémica de la respuesta inmune innata en la EPOC y justifican una mayor investigación sobre el papel de la disfunción de los macrófagos inducida por CS en la mediación de patologías distales del pulmón.
Métodos
Modelo de exposición al humo de cigarrillos y ratones.
Se adquirieron ratones C57BL/6 J de tipo salvaje (n.º de stock 000664) de The Jackson Laboratory y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en Weill Cornell Medicine. Se expuso a ratones del mismo sexo y edad de entre 6 y 12 semanas de edad a CS de todo el cuerpo utilizando el aparato de exposición por inhalación TE-10 de Teague Enterprises y cigarrillos 3R4F adquiridos en el Centro de Productos de Referencia del Tabaco de la Universidad de Kentucky. Los ratones fueron expuestos a CS (materia particulada total (TPM) promedio de 150 mg/m3) durante un mínimo de 2 h por día durante 5 días a la semana, durante un período de 8 semanas.
Aislamiento AM y BMDM
Los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 siguiendo el régimen de exposición a CS. Después de la traqueostomía y la intubación con un catéter de 20G × 1 ″ (SR-OX2025CA; Terumo), los pulmones de los ratones se lavaron utilizando incrementos de 0,5 ml de PBS helado (10,010–023; Life Technologies) suplementado con EDTA 0,5 mM (351–027- 061; Calidad Biológica), hasta un total de 4 ml. Los sedimentos celulares se recogieron mediante centrifugación a 500 xg durante 5 minutos a 4 ° C y se trataron con 1 ml de tampón de lisis de RBC (R7757, Sigma-Aldrich). Después de una incubación de 3 minutos, las células se centrifugaron a 500 xg durante 3 minutos a 4 ° C, se resuspendieron en 0,5 ml de PBS y se retiraron 20 µl para el recuento celular utilizando un hemocitómetro. La mayoría de las células lavadas eran macrófagos, y menos del 5% de la población eran neutrófilos o linfocitos.
Aislamiento y tratamiento de BMDM.
Se aislaron células de médula ósea del fémur y la tibia murinos a través de una aguja de 25 G con una jeringa de 12 ml llena con DMEM completo adjunto (11,995; Life Technologies). Los agregados celulares se eliminaron utilizando una aguja de 18 G y un filtro celular de 70 µM, después de lo cual la suspensión de células individuales se centrifugó a 1200 rpm durante 10 minutos. Las células se sembraron en DMEM completo suplementado con medio L929 al 10% durante 8 días.
Aislamiento y secuenciación de ARN.
Bulk RNA-Seq se realizó en AM y BMDM aislados de ratones WT y CS como se detalla anteriormente. El ARN total se extrajo usando el kit Qiagen RNEasy Micro (74,004) según las instrucciones del fabricante, y se usó 1 µg de ARN total para generar bibliotecas de RNA-Seq usando el kit Bioo. Las muestras se leyeron como lecturas de 150 pb de extremos emparejados en un High-Seq 4000 y las lecturas se alinearon con el genoma del ratón (GRCm38/mm10) usando STAR. Para todos los análisis se utilizaron puntos de corte de cambio absoluto > 1,5 y p < 0,05 ajustado por Benjamini-Hochberg.
Análisis bioinformáticos
Los genes codificantes de proteínas (DEG) expresados diferencialmente se determinaron mediante DeSeq2 (https://github.com/lovelab/DESeq2). Los gráficos de volcán de expresión génica se generaron a través de ggVolcanoR (https://ggvolcanor.erc.monash.edu/). Para el análisis de ontología genética, se introdujeron en ShinyGO genes expresados diferencialmente regulados hacia arriba y hacia abajo (http://bioinformatics.sdstate.edu/go/; v.0.77). Se utilizó el análisis de vías de ingenio para identificar vías canónicas y predecir los reguladores ascendentes.
Resultados
Los BMDM de ratones expuestos a CS muestran remodelación transcriptómica
La infiltración de monocitos al pulmón desde la circulación es una característica bien reconocida de la progresión de la EPOC. Para investigar el transcriptoma de estas células, generamos macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) a partir de ratones expuestos durante 8 semanas como se describió anteriormente (34). Analizamos lecturas de secuenciación de ARN en masa alineadas preparadas a partir de ARN aislado de estos BMDM junto con las generadas a partir de controles expuestos al aire ambiente (RA) (Fig. 1A) (35). Después del análisis de DeSeq2 utilizando puntos de corte de cambio absoluto > 1,5 y p ajustado < 0,05, nuestro análisis identificó 448 genes expresados diferencialmente en respuesta a la exposición al CS, con 190 genes regulados negativamente y 258 genes regulados positivamente (Fig. 1B). El gen con regulación positiva más significativa tras la exposición al CS fue Srm, que codifica el gen de biosíntesis de espermidina espermidina sintasa; Wdfy3, el gen más significativamente regulado a la baja, codifica una proteína adaptadora involucrada en la macroautofagia selectiva y fue previamente identificado como un regulador de la eferocitosis de los macrófagos.36). El análisis de ontología genética (GO) de genes regulados positivamente mostró enriquecimiento para procesos relacionados con la bioenergética mitocondrial, incluida la fosforilación oxidativa (OXPHOS, GO:0006119) y la producción de ATP (GO:0046034), mientras que los genes regulados negativamente mostraron enriquecimiento para histonas (GO:0034968) y proteínas. metilación de lisina (GO:0018022) (Fig. 1DO). Para dilucidar aún más los efectos de la CS en las vías transcripcionales, a continuación utilizamos Ingenuity Pathway Analysis (IPA), donde los genes codificadores de proteínas se compararon con la base de conocimientos de Ingenuity Pathway para identificar vías canónicas enriquecidas en genes expresados diferencialmente, asignando una puntuación z positiva. a las vías activadas por la exposición al CS y una puntuación negativa a las inhibidas. La señalización de sirtuina fue la vía canónica más significativamente enriquecida (puntuación z absoluta > 2, p < 0,00001),...
