Resumen
Antecedentes
Recientemente informamos que el receptor 1 acoplado a la proteína de cáncer G de ovario (OGR1) puede sesgarse farmacológicamente con benzodiacepinas específicas para unir proteínas G heterotriméricas heterotriméricas en las células lisas de las vías respiratorias humanas (ASM). Lorazepam estimuló la señalización de GS y GQ a través de OGR1, mientras que el sulazepam solo estimuló la señalización de GS en las células ASM. El presente estudio buscó determinar los efectos del sulazepam y el lorazepam sobre la contracción de las rodajas pulmonares de corte de precisión humana (HPCL) y detallar los mecanismos bioquímicos que median estos efectos.
Métodos
Los modelos de contracción estimulada por histamina (His) incluyeron imágenes de cortes pulmonares de corte de precisión humano ex vivo (HPCLS) y análisis de citometría de torsión magnética (MTC) de la rigidez de las células ASM humanas. Para explorar los mecanismos de regulación, examinamos los efectos sobre la fosforilación de la cadena ligera de miosina (PMLC) y la actividad de PKA en cultivos de ASM humanos primarios, así como la integridad del citoesqueleto de actina, según lo definido por los cambios en la relación de F a G, la actina evaluada por la inmunofluorescencia.
Resultados
De una manera dependiente de la dosis, el sulazepam relajó los HPCL con contratado con sus his y la reducción de la rigidez de la célula basal. Lorazepam no relajó HPCL con sus controlados, y solo a una dosis máxima (100 μm) relajó la rigidez de la célula basal de Lorazepam. El ligando sesazepam sesgado por GS estimuló la actividad de PKA como lo demuestra la inducción significativa de la fosforilación de VASP y HSP20, que se asoció con una inhibición significativa de la fosforilación de PMLC inducida por HIS. Por el contrario, el ligando equilibrado lorazepam no aumentó significativamente la fosforilación de HSP20 o la fosforilación de VASP y no inhibió significativamente la fosforilación de MLC inducida por HIS. El sulazepam también fue capaz de inhibir la formación de F-actina inducida por histamina.
Conclusiones
El ligando OGR1 sesgado GS relajó ASM contraído en los modelos basados en tejidos y células, mediante la inhibición de la fosforilación de MLC de manera dependiente de PKA y mediante la inhibición de la formación de fibra de estrés por actina. La incapacidad relativa del ligando equilibrado lorazepam para influir en el estado contráctil ASM probablemente se debió a acciones competitivas de la señalización concomitante de GQ y GS.
Introducción
Condiciones que dan como resultado un pH bajo en la vía aérea, como los cambios en el medio ambiente (niebla ácida) (1), microaspiración de reflujo ácido (2, 3) o inflamación (4, 5), contribuye a los mecanismos neuronales asociados con la contracción de las vías respiratorias (6). El pH bajo puede activar las neuronas aferentes para estimular la liberación de broncoconstrictores como la acetilcolina (ACH) (7, 8). Los valores de pH de la respiración exhalada (EBC) muestran una correlación negativa significativa con los marcadores inflamatorios asociados con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el asma, con la normalización del pH después de la resolución de la inflamación de las vías respiratorias por tratamiento con corticosteroides inhalados (3, 4). Los estudios iniciales en nuestro laboratorio se centraron en la hipótesis de que el pH bajo en la vía aérea juega un papel patogénico en la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias al activar directamente los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de detección de protones (GPCR) en el músculo liso de las vías respiratorias (ASM). Los estudios revelaron que el receptor 1 acoplado a la proteína de cáncer G de ovario 1 (OGR1; AKA GPR68) es el GPCR de detección de protones predominante en las células ASM humanas, y las reducciones incrementales en el pH extracelular (PHO) estimulan Ogr1 en las células ASM para aumentar la rigidez celular9).
En estudios posteriores, determinamos las benzodiacepinas específicas, a saber, lorazepam y sulazepam, para ser agonistas de OGR1 (10), un descubrimiento que ayudó a superar las dificultades inherentes de estudiar un receptor cuyo ligando afín es el protón (promiscuo) (6). También determinamos que puede ocurrir una señalización “sesgada” de OGR1, formando así la base para “sintonizar” selectivamente OGR1. Más específicamente, el lorazepam de benzodiacepina se comportó de manera equilibrada, estimulando la movilización del calcio intracelular y la activación de P42/P44 de manera dependiente de GQ, pero también provocando la generación de AMPc que sugiere el reclutamiento de la señalización de GS a través de OGR1 en ASM. Por el contrario, el sulazepam solo estimuló la señalización de GS en ASM, definiendo el sulazepam como sesgado de GS (11). Además, el sulazepam, a diferencia de Lorazepam y PHO reducido, demostró resistencia a la desensibilización de OGR1 inducida por agonistas (12). Más recientemente, demostramos que el tratamiento profiláctico de ratones con sulazepam inhibe el desarrollo de la hiperreactividad de las vías respiratorias en un modelo murino de asma inducida por alérgenos (13). Colectivamente, estos estudios subrayan el valor terapéutico potencial de las benzodiacepinas en la regulación del estado contráctil ASM.
Sin embargo, los mecanismos que median los efectos anticontractiles de las benzodiacepinas en el estado contráctil ASM siguen siendo poco definidos. En el presente estudio, caracterizamos los efectos de lorazepam y sulazepam en el estado contráctil ASM en las rodajas pulmonares de precisión humana (HPCL) y las células ASM humanas cultivadas, y detallan los mecanismos subyacentes a estos efectos.
Materiales y métodos
Anticuerpos y otros reactivos
Los anticuerpos contra la cadena ligera de miosina fosforilada reguladora 2 (PMLC; Threonine 18, Serina 19) y la fosfoproteína estimulada por vasodilatadores (VASP) se compraron a través de la tecnología de señalización celular (Danvers, MA). La proteína de choque térmico fosforilada 20 (PHSP20; serina 16) se adquirió a través de ABCAM (Boston, MA). El anticuerpo de β-actina, el lorazepam y el isoproterenol (ISO) se adquirieron de Millipore Sigma (St. Louis, MO). Sulazepam se obtuvo de las especificaciones (ZoerterMeer, Países Bajos).
ASM humano (HASM) Cultivo celular
Las células ASM humanas primarias (pasajes 2-6) se establecieron a partir de tráqueas humanas obtenidas de donantes no asmáticos no identificados como se describió anteriormente (12, 14, 15). Las células se cultivaron en el medio F12 de jamón suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y se mantuvieron en una incubadora de 37 ° C con CO2 al 5% hasta la confluencia y posteriormente hambriento en medio sin suero como PER ((((((12, 14).
Rebanadas pulmonares cortadas de precisión humana (HPCLS)
Se generaron rodajas pulmonares de corte de precisión humana a partir de núcleos de pulmón humano derivados de donantes como se describió anteriormente (16) y utilizado como modelo para estudiar la regulación de la broncoconstricción por sulazepam y lorazepam. El uso de núcleos pulmonares humanos desidentificados y cultivos de células ASM humanas, para fines experimentales, fue aprobado por la Universidad de Rutgers y las juntas de revisión institucional de la Universidad Thomas Jefferson. Brevemente, los HPCL se generaron cortando núcleos de pulmón transversalmente a 350 μm y se mantuvieron cortes en los medios F12 de Ham suplementados con Primocin® (Invivogen, San Diego, CA) a 37 ° C en una incubadora suplementada con 5% de CO2. Las vías respiratorias se lavaron y se utilizaron en experimentos detallados a continuación. Se examinaron múltiples vías respiratorias, en PCL derivadas de 2 donantes distintos.
Para examinar la efectividad de las benzodiacepinas en la regulación de la relajación, los HPCL se estimularon con su (1 μM) durante 15 minutos y posteriormente se trataron con dosis crecientes de lorazepam o sulazepam (0.1 nm – 100 μM), o 1 μM (ISO), 10 minutos de incubación por cada dosis. Las imágenes se tomaron antes y después de su tratamiento, luego después de la incubación de cada dosis de sulazepam o lorazepam. El análisis de datos se realizó como se describió anteriormente (16).
Citometría de torsión magnética (MTC)
Los cambios en la rigidez de las células ASM, una medida sustituta del estado contráctil ASM, se midieron utilizando MTC como se describió anteriormente (11). Brevemente, las microperlas ferrimagnéticas recubiertas de RGD se funcionalizaron al citoesqueleto (CSK) de las células HASM adherentes a través de los receptores de integrina de la superficie celular, magnetizados horizontalmente al enchapado celular y retorcidos en un campo magnético alineado verticalmente que variaba sinusoidalmente en el tiempo. El campo magnético antes mencionado provoca una rotación y un movimiento de giro de las microperlas que se inhibe por el rígido o el estresante de la célula. La resolución espacial del par oscilatorio del desplazamiento lateral de las perlas fue de ~ 5 nm, y la relación de dicho par al desplazamiento del perlas nos dio nuestra rigidez celular en las unidades PASCAL/NM y se expresó como una relación de rigidez inducida a la rigidez inicial o como la relajación porcentual de la rigidez celular precontracida. Para cada individuo, los efectos de células ASM de lorazepam y sulazepam se evaluaron primero midiendo la línea de base durante 60 s y luego tratando con sulazepam o lorazepam (25, 50 o 100 μM) durante los siguientes 300 s.
Inmunotransferencia
Para examinar la regulación de MLC, los cultivos de ASM humanos se cultivaron hasta la confluencia y sujetos a privación sérica durante 72 h. Las células se pretrataron con sulazepam, lorazepam, vehículo (0.1% DMSO) o ISO durante 10 minutos y posteriormente se trataron con el suyo durante 10 minutos adicionales. Para estos estudios, el suyo se usó como agonista contráctil dada la variabilidad de la respuesta a MCH que ocurre con la pérdida progresiva de los receptores de acetilcolina muscarínica M3 que ocurre después del paso 2 de los cultivos ASM humanos ((15, 17, 18). Las células se lisaron en una solución 1 × RIPA, y los lisados celulares sometidos al procedimiento de transferencia Western como se describió anteriormente (19). Después de la electroforesis y la transferencia a las membranas de nitrocelulosa, las membranas se incubaron durante 1 hora a la RT con solución salina tamponada con tris que contenía 0.2% Tween-20 (TBST) que contenía albúmina sérica bovina al 3% (BSA; W/V). Las membranas se incubaron luego a 4 ° C durante la noche con anticuerpos contra PMLC (1: 1000 en 3% de BSA), VASP (1: 5000 en 3% BSA), PHSP20 (1: 1000 en 3% BSA) y β-actina (1: 50,000 en 3% BSA). Al día siguiente, las membranas se lavaron brevemente con TBST y se incubaron a RT durante 1 h con anticuerpos secundarios (1: 10,000 dilución en TBST) conjugados con colorantes infrarrojos (Li-Cor; Lincoln, NE). Las bandas inmunorreactivas se cuantificaron utilizando el Li-Cor Image Studio ™.
Regulación del citoesqueleto de actina
Las células HASM primarias se plantearon en cubreobjetos recubiertos durante la noche, se hambrionaron durante 72 h y luego se pretrataron con sulazepam durante 10 minutos. Las células fueron tratadas con medios basales o suyo durante 5 minutos. Las células se fijaron en una solución de PFA al 4% y los teñidos que utilizan faloidina rodamina (F-actina; dilución 1: 100) y Alexa Fluor 488 DNasa I (G-actina; dilución 1:50). Fluorescencia…
(Tagstotranslate) Benzodiacepinas (T) Músculo liso de la vía aérea (T) Ogr1 (T) GPCR (T) Sistema de neumología/respiratoria
