Resumen
Antecedentes
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI), que afecta predominantemente a personas mayores de 60 años, se ha estudiado principalmente en modelos de ratones jóvenes. La eficacia limitada de los tratamientos actuales subraya la necesidad de modelos animales que imiten mejor a una población de pacientes de edad avanzada. Abordamos esto induciendo fibrosis pulmonar en ratones de edad avanzada, utilizando imágenes de micro-CT longitudinal como lectura principal, con especial atención al bienestar animal.
Métodos
Se administró una dosis doble de bleomicina a ratones macho C57Bl/6j de 18 a 24 meses de edad para inducir fibrosis pulmonar. La dosis de bleomicina se redujo hasta un 75% en comparación con la que se administra comúnmente a ratones jóvenes (de 8 a 12 semanas de edad), lo que resultó en fibrosis pulmonar a largo plazo sin mortalidad, cumpliendo con las pautas de bienestar animal. Después de la inducción de la fibrosis, los animales recibieron nintedanib una vez al día durante dos semanas y se controlaron longitudinalmente mediante micro-CT, que proporcionó biomarcadores estructurales y funcionales, seguido de un análisis histológico post mortem como criterio de valoración terminal.
Resultados
En comparación con los ratones jóvenes, los animales de edad avanzada mostraron un mayor volumen, una reducción de la densidad y función del tejido y una marcada inflamación. Esta mayor vulnerabilidad impuso una reducción de la dosis de bleomicina al nivel más bajo probado (2,5 µg/ratón), induciendo una fibrosis más leve, pero persistente, al tiempo que se preserva el bienestar animal. El tratamiento con nintedanib redujo las lesiones fibróticas y mejoró la función pulmonar.
Conclusiones
Nuestros datos identifican un tratamiento reducido con bleomicina que permite lograr el mejor equilibrio entre la inducción de fibrosis y el bienestar animal, un requisito para las pruebas de fármacos antifibróticos en pulmones envejecidos. Nintedanib mostró una eficacia significativa en este modelo de enfermedad de menor gravedad, lo que sugiere posibles estrategias de estratificación de pacientes. La patología pulmonar se evaluó cuantitativamente mediante micro-CT, lo que señala el valor de los criterios de valoración longitudinales en los ensayos clínicos.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar crónica y progresiva, caracterizada por un depósito anormal de matriz extracelular y lesiones fibróticas en los pulmones, que en última instancia conducen a insuficiencia respiratoria.1, 2). En la actualidad, la FDA y la EMA sólo han aprobado dos fármacos, a saber, pirfenidona y nintedanib, como tratamientos terapéuticos para la FPI. Desafortunadamente, sin embargo, sólo retrasan la progresión de la enfermedad en casos de gravedad leve a moderada (3). A pesar de grandes esfuerzos y estudios preclínicos rigurosos destinados al descubrimiento de nuevos fármacos, muy pocos han surgido como candidatos potenciales adecuados para su traducción en tratamientos eficaces para la FPI. El reciente fracaso de los ensayos clínicos de fase 3 para el anticuerpo anti-CTGF pamrevlumab (4) y el inhibidor de la autotaxina ziritaxestat (5), subraya aún más la brecha, en términos de traducibilidad, entre los estudios preclínicos y la práctica clínica. Parte de las dificultades con la traducción clínica se pueden atribuir a la supervisión de la relación entre la FPI y el envejecimiento en el proceso de descubrimiento de fármacos. De hecho, la FPI afecta principalmente a personas de mediana edad y de edad avanzada, y su incidencia aumenta con la edad. A pesar de esta incidencia relacionada con la edad, la mayoría de los candidatos a fármacos antifibróticos se han probado preclínicamente en animales jóvenes (8 a 12 semanas, similar a los humanos de 18 a 25 años) (6), con muy pocos estudios realizados en ratones de mayor edad (18 a 24 meses, equivalente a humanos de 56 a 69 años) (7). Esto puede explicarse por la limitada disponibilidad en el mercado y el alto costo de los ratones viejos, así como por los esfuerzos necesarios para la cría interna y el mantenimiento de las colonias.
Estudios previos sobre la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (BLM) en ratones ancianos han proporcionado una imagen incompleta y a veces contradictoria (8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23). Como observación general, se ha informado que los animales jóvenes muestran una recuperación más rápida del tratamiento con BLM, probablemente debido a una duración más corta de la activación de los fibroblastos.8), mientras que los ratones más viejos sufren una fibrosis más prolongada debido a su capacidad de reparación disminuida (8, 9). Algunos estudios informan de una fibrosis más grave en ratones ancianos en comparación con animales más jóvenes (10, 11), mientras que otros encuentran niveles comparables de fibrosis en diferentes grupos de edad (12). Curiosamente, tanto los animales fibróticos jóvenes como los viejos exhibieron perfiles transcriptómicos y metabolómicos similares (13, 14), y respondieron de manera similar a la terapia antifibrótica (15, 16).
En conjunto, los estudios mencionados anteriormente han dejado muchas cuestiones sin abordar, en particular la falta de una caracterización detallada de la fibrosis pulmonar en ratones de edad avanzada y un conocimiento incompleto de la progresión temporal de la enfermedad. Estas lagunas pueden cubrirse mediante metodologías in vivo, como la tomografía microcomputarizada (micro-CT), que permiten el seguimiento longitudinal y la extrapolación de trayectorias individuales de fibrosis pulmonar. Recientemente, la micro-CT se ha convertido en una valiosa herramienta de investigación preclínica, capaz de cuantificar longitudinalmente la progresión de la enfermedad y la respuesta a tratamientos terapéuticos in vivo.24,25,26,27). Potencialmente, esto podría llenar muchos de los vacíos en nuestra comprensión actual de la fibrosis pulmonar en ratones mayores.
Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue (a) comparar las características pulmonares en ratones de edad avanzada (de 18 a 24 meses) con las de ratones jóvenes (de 8 a 10 semanas de edad); (b) desarrollar un modelo de FPI en ratones envejecidos bien caracterizado que utilice cantidades adecuadamente graduadas de bleomicina para inducir eficazmente la fibrosis pulmonar, garantizando al mismo tiempo el bienestar animal; (c) evaluar con precisión la respuesta al tratamiento con nintedanib (NINT), utilizado como fármaco de referencia aprobado para uso clínico. Empleamos micro-CT para obtener biomarcadores pulmonares estructurales y funcionales longitudinales, utilizando el análisis histológico como criterio de valoración final.
Materiales y métodos
Animales de experimentación
El estudio se realizó en 55 ratones macho C57Bl/6j, proporcionados por Inovit (San Pietro al Natisone, Italia), que incluyó un grupo de 42 ratones de 18 a 24 meses (ratones envejecidos) y 13 ratones de 8 a 10 años. -semanas de edad (ratones jóvenes). A su llegada, los animales se aclimataron durante 20 días a las condiciones del vivero local (temperatura ambiente: 20–24 °C; humedad relativa: 40–70%; ciclo de luz y oscuridad de 12 h; comida y agua ad libitum).
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y de conformidad con la Directiva Europea 2010/63 UE. D.Lgs 26/2014 de Italia y la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio” revisada (Comité del Consejo Nacional de Investigación, EE. UU., 2011). Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación certificada por AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación para el Cuidado de Animales de Laboratorio) en Chiesi Farmaceutici y fueron autorizados por el Ministerio de Salud italiano con el número de protocolo 742/2022-PR y por el AWB (Organismo de Bienestar Animal) interno. ). Se tomaron todas las precauciones necesarias para reducir el sufrimiento o el malestar de los animales, y un veterinario designado o técnicos capacitados evaluaron los niveles de dolor diariamente utilizando una escala visual analógica (EVA) que iba de 0 a 10. Los resultados humanos incluyeron disnea, pérdida de peso del 20% o más y una puntuación VAS de 6 o superior.
protocolo experimental
El protocolo experimental se compone de tres etapas distintas. La primera etapa implica una comparación inicial entre ratones viejos no tratados y ratones jóvenes. La segunda etapa es un estudio para determinar la dosis adecuada de bleomicina. La etapa final es un estudio de validación farmacológica. El número de ratones utilizados en cada etapa, junto con la configuración experimental, se resume en la Fig. 1.
Figura 1El protocolo experimental y la búsqueda de dosis se reducen. Representación esquemática del protocolo experimental. (a) Comparación entre ratones jóvenes y ancianos no tratados: 55 ratones macho C57Bl/6j se sometieron a micro-CT al inicio del estudio (42 de edad y 13 jóvenes). Se sacrificaron 6 animales para evaluación histológica. (b) Estudio de búsqueda de dosis de bleomicina (BLM): 34 ratones fueron tratados los días 0 y 4 con solución salina (n = 5 ancianos y n = 4 jóvenes) o dosis variables de BLM (n = 19 ancianos y n = 6 jóvenes) por administración orofaríngea. Los ratones se sometieron a micro-CT los días 7, 14 y 21 y se sacrificaron para evaluación histológica al final del estudio. (do) Estudio de validación farmacológica: 15 ratones de edad avanzada fueron tratados los días 0 y 4 con solución salina (n = 5) o BLM (n = 10). El día 14, los ratones tratados con BLM se aleatorizaron para ser tratados con Nintedanib (n = 5) o vehículo (n = 5). Se realizó micro-CT los días 7, 14, 21 y 28 y se sacrificó para evaluación histológica al final del estudio.
Imagen a tamaño completo-
a.
Comparación entre jóvenes y ancianos no tratados. Todos los ratones (42 de edad y 13 jóvenes) se sometieron a micro-CT al inicio del estudio, luego se sacrificaron 6 animales (3 jóvenes y 3 de edad) para comparar la evaluación histológica de la simulación joven y envejecida.
-
b.
Hallazgo de dosis de bleomicina. Se seleccionaron aleatoriamente 34 ratones para el estudio de búsqueda de dosis. Se indujo fibrosis pulmonar en 25 ratones (19 de edad y 6 jóvenes) utilizando bleomicina (Baxter Oncology GmbH) diluida en 50 µl de solución salina (0,9%) mediante una administración orofaríngea doble (día 0, 4), mientras que 9 ratones sirvieron como controles de solución salina ( 5 mayores y 4 jóvenes). Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2,0% en oxígeno y colocados en la plataforma de intubación, colgados de sus incisivos sobre un alambre. Usando un laringoscopio pequeño, se sacó la lengua firme pero suavemente con unas pinzas y con una micropipeta se introdujo el líquido en la parte distal de la orofaringe mientras se cerraban suavemente las fosas nasales.28, 29).
Dado que, en nuestra mano, ratones machos C57Bl/6j adultos jóvenes que recibieron una inyección doble de BLM a 10 µg/ratón desarrollaron una fibrosis pulmonar sostenida durante hasta 21 días, se ha utilizado el mismo esquema de dosis (doble instilación de BLM de 10 µg/ratón). propuesto inicialmente para ratones de edad avanzada, seguido de una reducción gradual de la dosis. Probamos cuatro…
