Uso de esferoides tumorales multicelulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas para estudiar el impacto de la quimioterapia

Abstracto

Fondo

Los cánceres de pulmón representan la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Recientemente, la inmunoterapia sola o en combinación con quimioterapia ha tenido un profundo impacto en la atención terapéutica, lo que ha llevado a una mejor supervivencia general. Sin embargo, finalmente se producirá una recaída y hasta el momento no existe un tratamiento eficaz de segunda línea. Es necesario el desarrollo de nuevas terapias basadas en la comprensión de los mecanismos de resistencia. Sin embargo, las dificultades para obtener muestras tumorales antes y después del tratamiento de primera línea impiden comprender claramente las consecuencias de estas moléculas en las células tumorales y también identificar terapias de segunda línea adaptadas.

Métodos

Para superar esta dificultad, desarrollamos esferoides tumorales multicelulares MCTS utilizando líneas celulares caracterizadas de cáncer de pulmón de células no pequeñas NSCLC, monocitos de donantes sanos y fibroblastos. Los MCTS se trataron con combinaciones de carboplatino-paclitaxel o -gemcitabina según los esquemas de administración clínica. El impacto de los tratamientos se estudió mediante ensayos de viabilidad celular, análisis histológicos, secuenciación de 3'RNA, PCR en tiempo real, citometría de flujo y microscopía confocal.

Resultados

Demostramos que los tratamientos indujeron una disminución en la viabilidad celular y fuertes modificaciones en el perfil transcriptómico, especialmente a nivel de las vías involucradas en la reparación del daño del ADN y el ciclo celular. Curiosamente, también observamos una modificación de la expresión de genes considerados característicos de la respuesta a los inhibidores de los puntos de control inmunológico y de la inmunogenicidad, particularmente un aumento en CD274 expresión genética, que codifica PD-L1. Este resultado se validó a nivel de proteína y se demostró que estaba restringido a células tumorales en MCTS que contienen fibroblastos y macrófagos. Este aumento también se observó en una línea celular adicional, que expresaba niveles basales bajos. CD274 nivel.

Conclusiones

Este estudio muestra que los MCTS son modelos interesantes para estudiar el impacto de las terapias de primera línea utilizando condiciones cercanas a la práctica clínica y también para identificar terapias de segunda línea o concomitantes más adaptadas para el tratamiento del cáncer de pulmón.

Fondo

El cáncer de pulmón es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo. El cáncer/carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es el principal subtipo patológico de cáncer de pulmón y representa alrededor del 80-85% de ellos.1), y la mayoría de los pacientes se diagnostican en un estadio avanzado. Los inhibidores de puntos de control inmunológico (ICI) son un hito revolucionario en el campo de la oncología torácica, representados principalmente por anti-PD-1 (muerte programada-1) y anti-PD-L1 (muerte programada – ligando 1, también llamado B7-H1 o CD274) moléculas. Durante la última década, los ICI solos o en combinación con quimioterapia han sido el nuevo estándar de atención en el NSCLC avanzado irresecable sin impulsores oncogénicos, independientemente de los subtipos histológicos.1, 2). Varias ICI como pagembrolizumab, cemiplimab o atezolizumab mejoraron la supervivencia general (SG) en comparación con la quimioterapia en pacientes con NSCLC no tratados. Sin embargo, su eficacia se restringió a pacientes con alta expresión de PD-L1 en células tumorales (puntuación de proporción tumoral) ≥ 50% (2). Posteriormente, varios ensayos demostraron que una combinación de quimioterapia basada en platino más ICI era superior a la quimioterapia sola, independientemente de la expresión de PD-L1.3,4,5,6). Más recientemente, se ha demostrado que los ICI en combinación con quimioterapia basada en platino mejoran la supervivencia sin eventos en comparación con la quimioterapia sola (los datos de SG aún eran inmaduros pero parecían a favor del grupo de combinación) (7, 8) en pacientes con NSCLC localizado tratados en el entorno neoadyuvante. Por lo tanto, la quimioterapia basada en platino sigue siendo la columna vertebral del tratamiento del NSCLC, en etapa localizada o avanzada sin alteraciones oncogénicas abordables.

Las quimioterapias citotóxicas cambian las características biológicas de los tumores. Sin embargo, aún no está clara la forma en que la quimioterapia podría afectar a las células tumorales, las células del microambiente o ambas, y la forma en que también podría sensibilizarlas a los ICI. Una buena comprensión de las consecuencias de las terapias sobre las células cancerosas debería ayudar a mejorar la eficiencia del tratamiento actual de primera línea, y también a proponer terapias de segunda línea más adaptadas. De hecho, en caso de recaída, docetaxel o pemetrexed (para histología no escamosa) como agentes únicos son opciones terapéuticas preferidas si no se administran en primera línea, independientemente de los mecanismos de resistencia.2). La razón es que el estudio de los mecanismos de resistencia en los pacientes es un gran desafío, porque requeriría una nueva biopsia del sitio de recurrencia. Para superar estas limitaciones, se necesitan modelos preclínicos que ayuden a evaluar el impacto molecular de las terapias sistémicas en las células tumorales. De hecho, el cultivo celular 2D habitual carece de la arquitectura estructural y del microambiente tumoral (TME). Curiosamente, el cultivo celular en tres dimensiones (3D) reproduce notablemente barreras biológicas que dificultan en gran medida la administración de fármacos y las interacciones entre células que podrían afectar el estado de transición epitelial a mesenquimal de las células. Estos modelos se utilizan hoy en día principalmente para evaluar la eficacia de las terapias y representan un campo de desarrollo en crecimiento, en particular aquellos que incluyen células TME (9).

En este trabajo, utilizamos modelos de esferoides tumorales multicelulares (MCTS) constituidos por células tumorales de NSCLC, con o sin microambiente, fibroblastos y monocitos, para estudiar el impacto de las quimioterapias basadas en platino, carboplatino-paclitaxel o carboplatino-gemcitabina. También evaluamos el impacto de este tratamiento mediante secuenciación de 3'RNA, citometría de flujo y PCR en tiempo real.

Métodos

Células

Los monocitos humanos se aislaron recientemente mediante clasificación magnética a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios sanos siguiendo el protocolo del fabricante (kit clásico de aislamiento de monocitos, Miltenyi Biotec). La línea celular de cáncer de pulmón ADCA117 se estableció a partir del líquido pleural de un paciente con cáncer de NSCLC (10). La línea celular ADCA117 pertenece a una biocolección de muestras de pacientes del Hospital Universitario de Nantes, recolectadas de acuerdo con los estándares establecidos por la Declaración de Helsinki. Los pacientes reclutados no habían recibido terapias anticancerígenas previas y habían firmado su consentimiento informado. Todas las muestras recolectadas y la información clínica asociada se registraron en una base de datos (DC-2017-2987) validada por el Ministerio de Investigación francés. Este estudio fue aprobado por un comité de ética local (CPP Ouest-IV-Nantes). Las otras líneas celulares de NSCLC (H1975 y H1437), así como la línea celular Human Foreskin Fibroblast-2 (HFF-2), se adquirieron de ATCC (LGC Standards). Las características de las líneas celulares de cáncer de pulmón utilizadas se resumen en la tabla T1. ADCA117 GFP y HFF-2 Ruby se obtuvieron mediante transducción utilizando partículas lentivirales y se seleccionaron utilizando puromicina a 5 µg/ml (Sigma-Aldrich). Estas líneas celulares se cultivaron en medio completo de glucosa RPMI-1640 o DMEM de 4,5 g/l (Gibco) suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml (Gibco) y suero de ternera fetal inactivado por calor al 10 %. (FCS) (Gibco), respectivamente, a 37 °C y 5% de atmósfera de CO2.

Formación de esferoides tumorales multicelulares (MCTS)

Las células tumorales se mezclaron con o sin monocitos de donantes sanos y HFF-2 (complejo MCTS) en una proporción de 2:0,5:0,5 (2 x 104 células totales) en placas de fondo en U de 96 pocillos NUNCLON SPHERA (Thermo Fisher Scientific) y en un volumen de 180 µL de medio de cultivo completo. Las placas se centrifugaron durante 2 minutos a 800 xg y se incubaron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 3 días.

Drogas

El carboplatino, el paclitaxel y la gemcitabina se obtuvieron en la farmacia del Hospital Universitario de Nantes.

Medición de viabilidad

Después de los tratamientos, se recogieron MCTS y se midió la viabilidad celular utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante utilizando un luminómetro (Mithras LB 940, Berthold Technologies).

3'RNASeq

Los MCTS se trataron con carboplatino 50 µM y paclitaxel 150 nM o carboplatino 50 µM y gemcitabina 100 nM el día 3, y luego con paclitaxel 150 nM o gemcitabina 100 nM solos los días 6 y 8. En el día 10, se recogieron los MCTS y se extrajo el ARNm utilizando el kit de ARN Nucleospin. (Macherey-Nagel). La calidad del ARNm se analizó utilizando el bioanalizador Agilent 20,100 (Agilent) en nanochips de ARN (Agilent).

Con respecto al análisis de genes, el perfil de ARN de secuenciación 3' se realizó mediante la plataforma GenoBird (IRS-UN, Nantes, Francia) utilizando un NovaSeq 6000 (Illumina Inc.) y un kit de reactivos NovaSeq 6000 SP de 100 ciclos (Illumina Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. protocolo (Guía del sistema de secuenciación NovaSeq 6000 Documento n.° 1000000019358v11 Material n.° 20 023 471, Illumina). El procedimiento completo se describe en Charpentier et al., Protocol Exchange (https://doi.org/10.21203/rs.3.pex-1336/v1). Las lecturas de secuencia sin procesar se filtraron según la calidad utilizando FastQC. Las secuencias adaptadas se eliminaron de las lecturas de secuencia sin procesar utilizando Cutadapt. Luego, las lecturas se alinearon con el genoma de referencia utilizando BWA. Además, se detectaron expresiones diferenciales con el paquete DESeq2 Bioconductor.

Citometría de flujo

Los MCTS se trataron con carboplatino 50 µM y paclitaxel 150 nM o gemcitabina 100 nM el día 3 y con paclitaxel 150 nM o gemcitabina 100 nM los días 6 y 8. En el día 10, los MCTS se recogieron y se trataron con TrypLE express (Gibco) durante 10 a 120 min a 37 °C. Las células disociadas se incubaron con un anti-PD-L1 acoplado a ficoeritrina (PE) (557,924, BD), un anti-CD14 acoplado a aloficocianina (APC) (301,808, Biolegend), un anti-CD163 acoplado a BV421 (333,611, Biolegend ) o isotipos de control correspondientes. Después de dos lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se analizaron utilizando el citómetro de flujo FACSymphony™ A5 (BD Biosciences) y el software DIVA 8 (BD Biosciences).

PCR en tiempo real

El ARNm se extrajo utilizando el kit Nucleospin RNA (Macherey-Nagel). Se transcribieron de forma inversa 0,5 µg de ARN total utilizando la transcriptasa inversa MMLV (Invitrogen). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando QuantiTect Primer Assays (Qiagen) y RT.2 Mezcla maestra de PCR SYBR-Green/ROX en tiempo real (Qiagen) y realizada con QuantStudio™…

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