Resumen
Antecedentes
La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una enfermedad implacablemente progresiva y fatal con pocas terapias efectivas disponibles. La fibrosis es impulsada, en parte, mediante transiciones en estado celular de progenitores epiteliales dentro de las vías respiratorias que repoblen los alvéolos lesionados. Esta atipia alveolar afecta el intercambio de gases y estimula la producción de ECM. Intentamos examinar el papel de la señalización de BRD4 en la expansión del progenitor en la lesión pulmonar inducida por bleomicina.
Métodos
La activación del regulador epigenético de proteína 4 (BRD4) que contiene bromodominio en poblaciones distintas de células madre se cuantificó en un curso de tiempo de alta resolución de SCRNA-seq de lesión inducida por bleomicina, y se confirmó en estudios de SCRNA-seq en IPF humano. Un inhibidor de Brd4 potente, selectivo y biodisponible por vía oral (BRD4I, ZL0969) fue diseñado y sintetizado racionalmente. El efecto de Brd4i en la transición de miofibroblastos, la expansión de las células progenitoras y la fibrosis se evaluó utilizando un diseño experimental terapéutico en C57BL6/ratones.
Resultados
Encontramos que la vía BRD4 se induce rápidamente en la regeneración de las células alveolar activadas (AT) 2 y persiste en una población de progenitores KRT8 + profibróticos que expresan marcadores de transición mesenquimatosa epitelial, así como la senescencia. Para probar el papel funcional de la activación de BRD4, administramos un inhibidor BRD4 potente, selectivo y biodisponible por vía oral (Brd4i, ZL0969) con ~ 80 nm IC50 a ratones tratados con bleomicina. BRD4I redujo la formación de miofibroblastos y la deposición de ECM desnaturalizado (colágeno y laminina A1) en el espacio alveolar y puntajes de enfermedad mejorados. Es importante destacar que BRD4I redujo una población patogénica de células progenitoras alveolares que expresan integrina (ITG) -A6/B4, proteína 63 (TRP63) y queratina (KRT) relacionada con tumores. En ratones administrados una dosis de Bleomicina LD50, la inhibición de BRD4 mejoró significativamente su supervivencia y los marcadores reducidos de enfermedad.
Conclusiones
Estos datos demuestran que la inhibición de la señalización de BRD4 previene la expansión de los miofibroblastos y la expansión de una población progenitora epitelial patógena que controla la atipia alveolar y la fibrosis.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una enfermedad pulmonar intersticial progresiva e letal que conduce a la muerte por causas respiratorias dentro de los 3 a 5 años posteriores al diagnóstico en ausencia de intervención (1). La FPI puede ser el resultado de micro incrementos ambientales crónicos a un epitelio alveolar envejecido o senescente, lo que lleva a la expansión de las poblaciones endoteliales, mesenquimales y epiteliales defectivas de diferenciación, senescentes y profibróticos (2, 3). A medida que persiste esta vía de respuesta a la lesión, la FPI produce insuficiencia respiratoria a partir del cumplimiento pulmonar reducido, el intercambio de gases alterado, lo que lleva a la disnea y la hipoxemia. Debido a que actualmente faltan las terapias con la enfermedad inversa, una mayor comprensión de las respuestas celulares a los micro-lesiones puede conducir a una mejor terapéutica.
Los mecanismos de reparación alveolar se han investigado utilizando modelos de ratón de lesión pulmonar inducida por el agente que daña el ADN, bleomicina. La secuenciación de ARN de una sola célula (SCRNA-seq), el análisis de trayectoria y los estudios de linaje muestran que, tras la lesión difusa de las células alveolares, las poblaciones espacialmente distintas de células progenitoras regenerativas se expanden transitoriamente para repoblar las vías respiratorias y alvéolos inferiores (4, 5). Estas poblaciones incluyen células alveolares tipo 2 (AT2) cuboidales con propiedades de células madre latentes (6, 7) así como las distintas poblaciones progenitoras que surgen del pequeño parénquima de la vía aérea, denominadas células de «diferenciación alveolar intermedia (ADI)». Las células ADI se identifican mediante las firmas distintivas de las isoformas atípicas de queratina (KRT), la integrina A6B4 (ITGA6/ITGB4) y la proteína 63 (TRP63) (TRP63) (TRP63) (TRP63)8,9,10). Análisis de los perfiles transcripcionales Las células ADI han demostrado que esta población también expresa firmas genéticas de transición mesenquimatosa epitelial (EMT). Subrayando su papel en la reparación de lesiones, EMT es un espectro de cambios parciales en estado celular que resultan en des-diferenciación celular, pérdida de polaridad apical y adquisición de motilidad, lo que permite que esta población migre a áreas de epitelio denudado y repoble su superficie ((11). En las condiciones en las que ocurre la resolución de la lesión, estos progenitores transicionados mesenquimatosos se reflejan en células AT1 diferenciadas terminalmente para restaurar la función de barrera y apoyar el intercambio de gases ((12). Por el contrario, durante la lesión patógena no resuelta, la persistencia de Adis produce epitelio distrófico, interrumpiendo la arquitectura alveolar, promoviendo la fibrosis alveolar y el deterioro del intercambio de oxígeno (4, 13,14,15).
La proteína 4 que contiene bromodominio (BRD4) es un regulador epigenético maestro de las transiciones de estado celular, reparación de daños de ADN y control del ciclo celular. La mayoría de los estudios intensos en biología del cáncer, BRD4 es un «lector» de histona acetilada dual y acetiltransferasa atípica que contiene dos bromodominios tándem (BDS) funcionalmente distintos (BDS) (16, 17). Aquí, analizamos un estudio epitelial de SCRNA-seq de alta resolución en una lesión de bleomicina para encontrar patrones temporales distintos de activación de BRD4 en poblaciones regenerativas de células epiteliales. Aquí encontramos una inducción rápida y transitoria se produce en las células madre alveolares tipo 2 (AT2), y una inducción persistente posterior en los progenitores similares a KRT8+/TRP63+ «ADI». Para examinar el papel funcional de BRD4, utilizamos un enfoque de modelado/acoplamiento molecular para diseñar racionalmente un inhibidor de Brd4 selectivo, potente y biodisponible por vía oral (Brd4i, ZL0969) que inhibe ambos BDS (18). BRD4I se administró por vía oral a ratones tratados con bleomicina en un régimen terapéutico, en momentos correspondientes al pico de actividad de Brd4 durante la expansión de la población de células progenitoras Krt8 +/TRP63 +. Encontramos que BRD4I involucra su objetivo, reduce la expansión de la población progenitora epitelial similar a ADI patógena y mejora la supervivencia en respuesta a las dosis de LD50 de la administración de bleomicina. Estos datos son los primeros en demostrar que Brd4i interrumpe la expansión de un progenitores epiteliales patogénicos que controlan la atipia alveolar y la ECM desregulada en un modelo de ratón.
Métodos
Síntesis de ZL0969
ZL0969 se diseñó racionalmente utilizando un enfoque de acoplamiento molecular como se discutió más adelante y se sintetizó químicamente después de un protocolo sintético similar al de ZL0516, como se describió anteriormente ((22). Los procedimientos sintéticos detallados se proporcionan en la información de respaldo. Para el cultivo celular, ZL0969 se disolvió en dimetil sulfóxido (DMSO) y se diluyó directamente a concentraciones indicadas.
Acoplamiento molecular
Realizamos el estudio de acoplamiento molecular utilizando Schrödinger Small Molecule Drug Discovery Suite (Schrödinger, LLC, Nueva York, NY, 2022). Primero, la estructura de cocristal del compuesto de plomo anterior ZL0516 en complejo con BRD4 BD1 (ID de PDB: 6UWU) (18) se descargó, preparó y minimizó con el asistente de preparación de proteínas Schrödinger utilizando la configuración predeterminada. Luego, se creó una cuadrícula en el sitio de unión clásico de acetil lisina (KAC) con una caja de cuadrícula en tamaño de 20 Å en cada lado. El centro de la cuadrícula fue seleccionado en el centroide del ligando existente. A continuación, la estructura 3D del ligando ZL0969 se creó utilizando Schrödinger Maestro Sketcher y se preparó aún más con Schrodinger LigPrep. Se calculó una conformación de baja energía durante esta etapa y se utilizó aún más para el acoplamiento. El acoplamiento del ligando se empleó con Schrodinger Glide en la precisión SP y se produjeron 10 poses acopladas. Las poses acopladas se incorporaron al espectador de Schrödinger Maestro Post para la visualización. Se seleccionó una postura acoplada puntiaguda superior y se usó para el análisis y la demostración de interacciones del sitio de unión.
IC50 in vitro
Se cultivaron células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas humanas primarias inmortalizadas por telomerasa (HSAEC) en el medio de crecimiento de células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas (SAGM, Lonza, Walkersville, MD, EE. UU.) En el 5% de CO2. Para estimar IC50 del BRD4I ZL0969, se utilizó un modelo de activación inducida por TLR3 de genes innatos dependientes de BRD4 (19). Los HSAEC se pretrataron con ZL0969 en una serie de concentraciones de 0.01 µM a 100 µM durante 24 h y luego se estimularon durante 4 h con el agonista TLR3 Poly (I: C) a 10 µg/ml. Las células se lavaron dos veces con PBS y ARN total extraído usando extracción ácida de guanidinio fenol (TRI reactivo; Sigma). El ARN total se transcribió inversa para el análisis de expresión génica por PCR cuantitativa (RT-QPCR). La expresión inducida por poli (i: c) de la interleucina 6 (IL-6), el dominio de metionina S-adenosil radical RSAD2 que contenía 2 (RSAD2/CIG5), IL-8 e ISG54 se analizaron con la conversión de datos a porcentaje de controles estimulados por Poly (I: C). Los valores de IC50 se calcularon utilizando cuatro parámetros del método de regresión (https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator/).
Distribución, metabolismo y estudios farmacocinéticos (DMPK)
Los estudios de DMPK se realizaron en ratas macho Sprague Dawley en condiciones de GMP. Los compuestos se formularon en 10%DMSO/60%PEG400/30%de solución salina, y la vida media (T1/2), la concentración plasmática máxima lograda (CMAX) y la exposición total (AUC0-24 h) se determinaron después de una dosis única de administración. La biodisponibilidad oral (F) se determinó después de una dosis única administrada por sonda oral.
Modelo de ratón de lesión por bleomicina
Se utilizaron ratones machos C57BL/6J de catorce semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Para la instilación de bleomicina, los ratones se anestesiaron con isoflurano antes de que la bleomicina (hospital) se administrara por aspiración orofaríngea. En la primera serie de experimentos, se usó una dosis de 2.1U/kg, mientras que se usó una dosis LD50 de 2.2U/kg en la segunda serie. Los pesos corporales y la salud general de los animales fueron monitoreados diariamente en el transcurso del experimento. Los animales de control se alojaron en jaulas separadas mientras se trataban con solución salina normal (NS) el día 0 y luego desde el día 10 hasta el día 21 con el vehículo (DMSO y al 10% de hidroxipropil β-ciclodextrina).
El BRD4I ZL0969 se disolvió en DMSO y se diluyó en Hydroxypropil β-ciclodextrina al 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en PBS para la administración oral por sonda. ZL0969 …
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