Transición epitelial-mesenquimal inducida por el humo del cigarrillo mediada por GLUT3 en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica a través de la vía NF-kB/ZEB1

Resumen

Antecedentes

La remodelación de las vías respiratorias juega un papel importante en la patogénesis de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) es un proceso importante durante la remodelación de las vías respiratorias. Cada vez hay más pruebas que sugieren que el transportador de glucosa 3 (GLUT3) participa en el proceso de transición epitelial mesenquimatosa (EMT) de diversas enfermedades. Sin embargo, el papel de GLUT3 en la EMT en las células epiteliales de las vías respiratorias de pacientes con EPOC aún no está claro.

Métodos

Detectamos los niveles de GLUT3 en el tejido pulmonar periférico de pacientes con EPOC y ratones expuestos al humo del cigarrillo (CS). Se utilizaron dos conjuntos de datos Gene Expression Omnibus GEO para analizar los perfiles de expresión del gen GLUT3 en la EPOC. Se utilizaron transferencia Western e inmunofluorescencia para detectar la expresión de GLUT3. Además, utilizamos el inhibidor AAV9-GLUT3 para reducir la expresión de GLUT3 en el modelo de ratón. Se utilizó la tinción de Masson y la medición de la función pulmonar para detectar la deposición de colágeno y la penh en los ratones. Se realizó un estudio celular para confirmar el efecto regulador de GLUT3. Se utilizó la inhibición de la expresión de GLUT3 con ARNip, transferencia Western e inmunofluorescencia para detectar la expresión de E-cadherina, N-cadherina, vimentina, p65 y ZEB1.

Resultados

Según el análisis del conjunto de datos de GEO, la expresión de GLUT3 en pacientes con EPOC fue mayor que en los no fumadores. Además, GLUT3 se expresó altamente en pacientes con EPOC, ratones expuestos a CS y células BEAS-2B tratadas con extracto de CS (CSE). Investigaciones adicionales revelaron que la regulación negativa de GLUT3 alivió significativamente la remodelación de las vías respiratorias in vivo e in vitro. La medición de la función pulmonar mostró que la reducción de GLUT3 redujo la resistencia de las vías respiratorias en ratones experimentales con EPOC. Mecánicamente, nuestro estudio demostró que la reducción de GLUT3 inhibía la EMT inducida por CSE al regular negativamente la vía NF-κB/ZEB1.

Conclusión

Demostramos que CS mejora la expresión de GLUT3 en la EPOC y confirmamos además que GLUT3 puede regular la remodelación de las vías respiratorias en la EPOC a través de la vía NF-κB/ZEB1; Estos hallazgos tienen valor potencial en el diagnóstico y tratamiento de la EPOC. La regulación negativa de GLUT3 alivió significativamente la remodelación de las vías respiratorias y redujo la resistencia de las vías respiratorias in vivo. Nuestras observaciones descubren un papel clave de GLUT3 en la modulación de la remodelación de las vías respiratorias y arrojan luz sobre el desarrollo de terapias dirigidas a GLUT3 para la EPOC.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias y la tercera causa de muerte en el mundo, provocando más de 3,23 millones de muertes. La EPOC ha recibido mucha atención debido a su alta tasa de morbilidad, el enorme daño que causa y la pesada carga para la sociedad (1,2,3,4). La remodelación de las vías respiratorias, que contribuye a los importantes cambios patológicos en la EPOC, puede provocar obstrucción de las vías respiratorias, limitación irreversible del flujo de aire y disminución de la función pulmonar.5). Los recientes avances en la remodelación de las vías respiratorias en la EPOC han atraído gran atención debido a su creciente prevalencia.

Recientemente, varios estudios han encontrado que la EMT, transformación epitelial-mesenquimatosa, es un proceso clave en la remodelación de las vías respiratorias (6). La EMT participó en una serie de cambios regulatorios, provocando que las células epiteliales sufrieran una transformación y exhibieran motilidad y fenotipo de células epiteliales mesenquimales. Una manifestación importante de la EMT implica la regulación positiva de factores de transcripción (TF) clave específicos, como ZEB1, Snail y Twist (7,8,9). El proceso de EMT va acompañado de la disolución de las proteínas de unión adhesiva. La alteración de las conexiones, como una disminución en la expresión de E-cadherina, conduce a la disociación de las células epiteliales. Mientras tanto, el proceso EMT indujo la expresión de proteínas marcadoras mesenquimales, como la expresión mejorada de N-cadherina y vimentina. Significativamente, la E-cadherina es una molécula de adhesión celular y su función principal en las células es formar y mantener interacciones entre células. Por tanto, la pérdida de expresión de E-cadherina es un marcador importante de EMT. Unión de caja E con dedo de zinc Homeobox 1 (ZEB1) se considera un factor de transcripción en el proceso de EMT. Durante el proceso de EMT, conduce a la aparición de EMT al unirse a la secuencia de la caja E de la región promotora CDH1 e inhibir la expresión de E-cadherina (9, 10). La EMT ha sido implicada en las vías respiratorias en hipertrofia celular, metaplasia, modificación del epitelio y mutación genética.2). Algunos estudios han descubierto que el proceso EMT de las células epiteliales está estrechamente asociado con la patogénesis de la EPOC (6, 7), y su mecanismo potencial necesita más investigación.

El transportador de glucosa 3 (GLUT3), también conocido como SLC2A3, es un miembro importante de la familia de transportadores de glucosa (11). Los transportadores de glucosa desempeñan un papel clave en la captación de glucosa del extracelular al intracelular, siguiendo el gradiente de concentración.12). Se ha informado sobre la expresión de GLUT3 en cáncer gástrico, cáncer testicular, cáncer de ovario y cáncer de pulmón de células no pequeñas. Recientemente, un estudio demostró que en un modelo de adenocarcinoma de ratón, la inhibición de GLUT3 puede inhibir el desarrollo del tumor (13). La alta expresión de GLUT3 puede servir como un indicador de mal pronóstico para pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), promoviendo la aparición y desarrollo de EMT (14,15,dieciséis,17). Investigaciones anteriores han confirmado que GLUT3 puede desempeñar un papel importante en la aparición de EMT (18). Además, los estudios han demostrado que los transportadores de glucosa tienen algún efecto sobre el epitelio de las vías respiratorias (19). Las células epiteliales requieren energía para impulsar la proliferación celular y se dividen en secreciones y surfactantes, siendo la absorción de glucosa una importante fuente de energía.20). Nuestra investigación anterior encontró que SLC2A3 tenía una alta expresión en el tejido pulmonar de pacientes con EPOC. Sin embargo, el papel y los mecanismos moleculares específicos de GLUT3 en la remodelación de las vías respiratorias en la EPOC aún no están claros.

En este trabajo, analizamos el conjunto de datos GEO y encontramos que la expresión de GLUT3 fue mayor en pacientes con EPOC que en el grupo de control mediante biopsia de la mucosa bronquial. Posteriormente, detectamos un aumento en la expresión de GLUT3 tanto in vivo como in vitro bajo la estimulación del humo del cigarrillo y la EMT inducida por el humo del cigarrillo. Mecánicamente, GLUT3 reguló la aparición de EMT mediante la vía NF-κB/ZEB1 como punto de partida en las células epiteliales de las vías respiratorias, explorando los mecanismos moleculares de la remodelación de las vías respiratorias, la aparición y el desarrollo de la EPOC, y proporcionando nuevas ideas y objetivos terapéuticos para identificar biomarcadores del tabaquismo. -remodelación inducida de las vías respiratorias y prevención y tratamiento de la EPOC.

Materiales y métodos

Adquisición de datos

Los conjuntos de datos de microarrays publicados, GSE20257 (incluidas 23 muestras de EPOC y 53 de control) y GSE10006 (incluidas 27 de EPOC y 22 muestras de control) se recibieron de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) en el formato de datos MINiML. Generamos los dos conjuntos de datos anteriores utilizando la matriz GPL570 (HG-U133-Plus_2) Affimetrix Human Genome U133 Plus 2.0, los cuales son matrices de expresión genética. Se aislaron muestras epiteliales de las vías respiratorias de los sujetos con muestras de EPOC y de los grupos de control en los conjuntos de datos GSE20257 y GSE10006. Preprocesamos todos los conjuntos de datos sin procesar de GEO utilizando «affy» en R, incluida la normalización, la calibración de fondo y la conversión log2. Cuando varias sondas mapearon un gen común, se tomó el valor promedio como su valor de expresión.

Muestras humanas

El tejido pulmonar periférico de no fumadores, fumadores y pacientes con EPOC en este estudio se obtuvo de la lobectomía de nódulos pulmonares benignos y trasplante de pulmón en el Hospital Popular de Wuxi. Todos los pacientes con EPOC cumplieron los criterios de diagnóstico de GOLD 2023. Según la Declaración de Estambul, todos los donantes organizacionales en este estudio fueron voluntarios y se obtuvo su consentimiento informado. El Comité de Ética del Hospital Popular de Wuxi aprobó el protocolo del estudio. Después de recolectar tejido pulmonar periférico, se depositó en un tubo de ensayo y se almacenó rápidamente a -80°C para su uso posterior. La información clínica sobre la función pulmonar de los donantes de tejido pulmonar humano que participan en este estudio se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 Características clínicas de los sujetos.

Animales y establecimiento del modelo de EPOC en ratones.

Se criaron ratones C57BL6J (machos, de 6 a 8 semanas de edad) en equipos para animales en el Hospital Popular de Wuxi en la provincia de Jiangsu y se compraron a Changzhou Kawensi Experimental Animal Co., Ltd. (China). Los ratones fueron tratados humanamente siguiendo la aprobación y las directrices del Comité de Uso y Cuidado de Animales del Hospital Popular de Wuxi en la provincia de Jiangsu y las leyes pertinentes sobre manejo de animales experimentales en la provincia de Jiangsu. Los ratones fueron expuestos al humo de los cigarrillos Daqianmen (10 mg de alquitrán y 0,8 mg de nicotina/cigarrillo, Shanghai, China). Los ratones fueron expuestos a CS durante 2 h, dos veces al día, con un intervalo de 4 h, 7 días a la semana, durante 12 semanas en una caja de vidrio templado, un sistema de exposición sistémica. Además, estos ratones sirven como controles en un entorno seguro y similar sin exposición a ratones de la misma edad alimentados con CS.

Animales y administración de adenovirus.

El método para establecer un modelo de EPOC en ratones se ha descrito anteriormente. Genechem Technology Co., Ltd. (Genechem, China) sintetizó el inhibidor AAV9-GLUT3. Los ratones se dividieron en cuatro grupos (control, CS, CS + control negativo de AAV y CS + inhibidor de AAV9-GLUT3). El título del virus fue 5 × 1011 vg/ml. Antes de que los ratones fueran expuestos a CS, les inyectamos adenovirus por la nariz. El Cuidado de Animales aprobó todos los experimentos con animales y el Comité de Uso del Hospital Popular de Wuxi en la provincia de Jiangsu de acuerdo con las leyes sobre manejo de animales experimentales en la provincia de Jiangsu.

Medición de la función pulmonar

En el Centro Provincial de Jiangsu para el Control y la Prevención de Enfermedades, se utilizó la pletismografía de cuerpo entero para medir la función pulmonar en ratones (Buxko Electronics Co., Ltd., EE. UU.). Colocamos el ratón en una habitación conectada a un barorreceptor sensible y grabamos…

Truncado en 10000 caracteresTraducido automáticamente
Publicación Original

¿Quieres recibir semanalmente y gratuitamente todos los contenidos de Fisio One?

Artículos relacionados

Síntomas respiratorios y desenlaces en fumadores de cigarros: descubrimientos de las etapas 2 a 5 del estudio Evaluación de la Población del Tabaco y Salud (PATH) (2014-2019)

Síntomas respiratorios y desenlaces en fumadores de cigarros: descubrimientos de las etapas 2 a 5 del estudio Evaluación de la Población del Tabaco y Salud (PATH) (2014-2019)

ResumenContextoLos mecanismos que llevan al aumento del riesgo de padecer enfermedades respiratorias por fumar cigarros han sido investigados. A pesar de ello, se conoce menos sobre los riesgos de síntomas respiratorios y desenlaces vinculados al tabaquismo en...